賈 賀，張博愛，劉 宇，張小敏，姬亞杰，李 星，劉榮麗

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450052)

海馬是大腦邊緣系統(tǒng)重要組成部分，與學(xué)習(xí)和記憶有著密切的關(guān)系，尤其CA1區(qū)細(xì)胞承載著信息的加工、強(qiáng)化和傳遞功能。海馬血管構(gòu)筑的獨特性，使海馬成為腦內(nèi)對缺血最敏感的區(qū)域［1］。腦缺血可導(dǎo)致海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的一系列損傷性改變，在行為學(xué)上表現(xiàn)為長期的學(xué)習(xí)和記憶能力障礙。樹突是神經(jīng)元信息傳遞的入口，樹突棘是興奮性突觸傳遞的原始位點［2］，因此海馬錐體細(xì)胞樹突的形態(tài)及樹突棘結(jié)構(gòu)和功能的可塑性被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的細(xì)胞基礎(chǔ)。本實驗對大鼠行雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎(two－vessel occlusion，2VO)，經(jīng)快速灌注Golgi染色，研究慢性腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹突的分支、長度及樹突棘密度，以期為慢性腦缺血疾病的臨床研究和治療提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 動物和主要儀器

健康SD雌性大鼠，6月齡，體重320～350 g，由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗中心提供，隨機(jī)分為模型組和假手術(shù)組，每組45只，每組選取2周、4周8周3個時點，每個時點15只大鼠。KD－400型振動切片機(jī)。Morris水迷宮儀。

2 方法

2.1 慢性腦缺血模型建立 參照Ni等［3］的方法制備腦缺血大鼠模型。大鼠術(shù)前12 h禁食，4 h禁水。10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，保證手術(shù)期間有自主呼吸。仰臥固定，頸前部去毛消毒后沿頸正中切開，小心分離出雙側(cè)頸總動脈，分別結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈遠(yuǎn)心端和近心端，以確保阻斷頸總動脈血流，縫合皮膚。術(shù)中大鼠肛溫保持在36.5～37.5℃，手術(shù)后動物送至有通風(fēng)和空調(diào)設(shè)備的動物房飼養(yǎng)。

假手術(shù)組動物除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈外，余過程與模型組相同。

2.2 行為學(xué)評價及造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn) 從術(shù)后2周、4周、8周開始，分別將各組動物于Morris水迷宮中連續(xù)定位航行訓(xùn)練4 d，每天訓(xùn)練3次，每次采取不同的入水點訓(xùn)練120 s。若動物在120 s之內(nèi)找到平臺，使其在上停留15 s;若120 s之內(nèi)未找到平臺，則將其誘導(dǎo)到平臺上并停留15 s，方結(jié)束1次訓(xùn)練。如此訓(xùn)練4 d，分別記錄每只動物的潛伏期，潛伏期越短，路程越近，說明大鼠學(xué)習(xí)記憶能力越好［4］。

取第4 d假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期的均值為參考值，同時計算造模大鼠第4 d的平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期時間的比值，該值＞20%定為認(rèn)知功能障礙大鼠，即為造模成功的大鼠［5］。

2.3 取材及制片 對兩組大鼠分別于2周、4周、8周進(jìn)行快速灌注Golgi染色［6］(模型組選用造模成功的大鼠)。0.5%亞硝酸鈉液快速灌注至流出液體無血色，10%甲醛溶液灌注固定，使之充分將前液置換，靜置1～2 h。再用媒染液(5%水合氯醛，5%重鉻酸鉀，10%甲醛混合液)慢速灌注，至流出濃厚橘紅色液，略侯1～2 h。開顱取出大腦半球，從前中1/3處向后取組織塊約8 mm，浸泡于媒染液中，置暗處避光于37℃溫箱內(nèi)24 h。然后用1%硝酸銀溶液浸泡鍍銀，置暗處37℃溫箱內(nèi)3 d，每天換新銀液。用振動切片機(jī)經(jīng)海馬區(qū)冠狀位連續(xù)切片(切片厚100 μm)。切片分別經(jīng)2%重鉻酸鉀溶液、蒸餾水漂洗，依次脫水、透明、封片，光鏡下觀察。

2.4 圖像處理及分析 采集圖像，所有圖像均采用ImageJ軟件進(jìn)行分析。在每只大鼠的切片中，選擇海馬CA1區(qū)背景清晰且被染出錐體神經(jīng)元密度均勻的5張切片，每張切片測量4個形態(tài)完整的細(xì)胞，每組不同時點共選取80個細(xì)胞進(jìn)行觀察。

2.5 樹突分支、長度及樹突棘的密度測定

2.5.1 樹突的分支及長度 采用Sholl插件對樹突的分支及長度進(jìn)行統(tǒng)計，200倍顯微鏡下以神經(jīng)元胞體為圓心，做間距為10 μm的同心圓，統(tǒng)計樹突與同心圓的交點數(shù)之和，用交點總數(shù)反映樹突的分支和長度，見圖1。

2.5.2 樹突棘的密度 在1000倍油鏡下觀察樹突棘，從胞體發(fā)出的樹突第1次分支開始，計算30～60 μm長度范圍內(nèi)樹突棘的個數(shù)，以每10 μm樹突棘個數(shù)反映其密度。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較采用單因素方差分析，用LSD法進(jìn)行兩兩比較，組間均數(shù)的兩兩比較采用兩樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠的行為學(xué)改變

模型組大鼠潛伏期明顯延長，與假手術(shù)組比較有顯著差異(P＜0.05)，表明模型組大鼠記憶功能受損，出現(xiàn)一定的認(rèn)知功能障礙。并隨著缺血時間延長，認(rèn)知功能障礙顯著加重，見表1。

表1 各組大鼠潛伏期比較Table 1.The latency of rats in each group(.n=15)

表1 各組大鼠潛伏期比較Table 1.The latency of rats in each group(.n=15)

#P＜0.05 vs sham－operated;▲P＜0.05 vs 2 weeks;*P＜0.05 vs 4 weeks.

Group 2 weeks 4 weeks 8 weeks Sham －operated 38.31±30.36 38.43±20.32 37.38±22.71 Model 69.39±24.68# 74.65±29.54#▲ 98.48±20.95#*

2 樹突分支及長度的變化

2周模型組樹突的交點總數(shù)與相應(yīng)假手術(shù)組相比無明顯變化，組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);4周、8周模型組樹突交點總數(shù)與相應(yīng)假手術(shù)組相比均顯著減少(P＜0.01)。

模型組樹突的交點總數(shù)隨時間延長逐漸減少，4周組樹突交點總數(shù)較2周組顯著減少(P＜0.05)，8周組樹突交點總數(shù)較4 周組顯著減少(P ＜0.01)，見圖2、3。

Figure 3.Total number of intersection points of dendrites in hippocampal CA1 pyramidal cells in each group..n=80.＊＊P ＜0.01 vs sham;▲▲P ＜0.01 vs 2 weeks;△△P ＜0.01 vs 4 weeks.圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹突交點總數(shù)

3 樹突棘密度的變化

模型組樹突棘密度與相應(yīng)假手術(shù)組相比均顯著減少(P＜0.01);模型組樹突棘密度隨時間延長逐漸減少，4周組樹突棘密度較2周組顯著減少(P＜0.05)，8周組樹突棘密度較4周組顯著減少(P＜0.01)，見圖4、5。

Figure 4.Spine density in hippocampal CA1 pyramidal cells in each group(Golgi staining，×1000).A:2－week sham－operated group;B:2－week model group;C:4－week model group;D:8－week model group.圖4 海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹突棘

Figure 5.Spine density in hippocampal CA1 pyramidal cells in each group..n=80.＊＊P＜0.01 vs sham;▲▲P＜0.01 vs 2 weeks;△△P ＜0.01 vs 4 weeks.圖5 各組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹突棘密度

討 論

樹突是神經(jīng)元信息接收的重要區(qū)域，具有接收和整合突觸傳遞的功能。樹突表面有許多棘狀突起，稱樹突棘，是形成突觸的具體位點，樹突的分支、伸展長度及樹突棘均可擴(kuò)大神經(jīng)元接受刺激的表面積，在神經(jīng)元信息傳遞和加工中起著至關(guān)重要的作用［7］。慢性腦缺血是神經(jīng)系統(tǒng)一種常見的病理狀態(tài)，慢性腦缺血后能量代謝障礙，不能滿足組織需要，可導(dǎo)致認(rèn)知功能損害。Tsuchiya等［8］研究大鼠2VO術(shù)后腦血流變化，發(fā)現(xiàn)術(shù)后1周海馬血流量下降20%，皮質(zhì)血流量下降30%～45%，與此同時，海馬葡萄糖利用率亦明顯下降15%，皮質(zhì)葡萄糖利用率下降20% ～30%。術(shù)后8周到3個月海馬血流量下降約60%，腦低血流逐漸轉(zhuǎn)為慢性狀態(tài)［9］，并伴隨一系列神經(jīng)遞質(zhì)改變、腦白質(zhì)損害、神經(jīng)元缺失等病理改變［10］。Bennett等［11］通過研究慢性腦缺血神經(jīng)損傷機(jī)制，發(fā)現(xiàn)2VO術(shù)后大鼠海馬區(qū)內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞逐漸凋亡，且其凋亡數(shù)量與認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)。由此可見，海馬是腦內(nèi)缺血的敏感易損區(qū)，慢性腦缺血可導(dǎo)致海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的固縮、凋亡以及樹突損傷，從而構(gòu)成了進(jìn)展性認(rèn)知功能障礙的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。

大鼠2VO術(shù)后腦低血流改變與人類老齡化慢性腦缺血很相似，已被廣泛用來研究慢性腦缺血對認(rèn)知功能障礙的影響。水迷宮已被證實是評價大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的有效工具之一［4］。因此，本研究通過建立2VO模型，分別于腦缺血不同時點應(yīng)用水迷宮測量逃避潛伏期來判斷大鼠慢性腦缺血后認(rèn)知功能障礙程度，發(fā)現(xiàn)隨著缺血程度加重，大鼠認(rèn)知功能障礙顯著加重。

本實驗通過對慢性腦缺血海馬錐體細(xì)胞形態(tài)學(xué)及樹突棘密度的研究發(fā)現(xiàn)2周模型組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹突分支及長度減少較輕有關(guān)，可能與損傷時間較短，一部分血液代償使樹突損傷并不明顯。NO是一種血管舒張劑，研究發(fā)現(xiàn)2VO術(shù)后海馬區(qū)NO濃度可升高2周［9］，Mracsko等［12］發(fā)現(xiàn)在2VO模型早期，海馬和額葉皮層COX－2(cyclooxygenase－2)和eNOS(endothelial nitric oxide synthase)酶系水平增高，提示缺血引起血管興奮性反應(yīng)。這些反應(yīng)均可促使各種因子參與改善早期腦缺血及血管重建，起到一定代償作用。但隨著缺血時間延長，缺血缺氧程度加重，失代償后導(dǎo)致樹突分支及長度明顯減少。本實驗?zāi)Ｐ徒M樹突棘密度較假手術(shù)組均有顯著減少，表明慢性腦缺血對海馬CA1區(qū)的損傷確切。2VO術(shù)后腦血流量開始逐漸下降，引起腦內(nèi)糖代謝及ATP酶活性顯著下降，長期腦供血供氧不足，腦內(nèi)能量衰竭導(dǎo)致海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹突不可逆損傷，從而引起形態(tài)學(xué)改變及樹突棘脫落。微管相關(guān)蛋白(microtubule－associated protein 2，MAP－2)和網(wǎng)格蛋白參與細(xì)胞骨架的形成，與樹突微管形成密切相關(guān)，可反映樹突的分支、重塑，被認(rèn)為是對腦缺血高度敏感的標(biāo)記物。Kudo等［13］亦報道2VO術(shù)后6～8周MAP－2和網(wǎng)格蛋白表達(dá)均顯著下降。故可推斷慢性腦缺血后MAP－2和網(wǎng)格蛋白表達(dá)減少引起海馬錐體細(xì)胞樹突骨架蛋白及微管裝配異常，從而導(dǎo)致其分支及長度的減少及樹突棘的改變。樹突棘是突觸的具體位點。慢性缺血缺氧時NO等神經(jīng)毒性物質(zhì)釋放，神經(jīng)電活動受到抑制［9，14］，均可造成樹突棘大量脫落及結(jié)構(gòu)學(xué)的病理改變，改變突觸的功能，進(jìn)而導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶及認(rèn)知的缺陷。

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