郭茂娟，范英昌，盧 斌，姜希娟△

(天津中醫(yī)藥大學(xué)1病理三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，2病理教研室，天津 300193)

越來越多的研究認(rèn)為外周膽固醇升高會(huì)上調(diào)腦膽固醇水平，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元結(jié)構(gòu)受損、功能降低，誘發(fā)阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)，有研究甚至認(rèn)為膽固醇代謝紊亂是AD病理生理的核心［1］。因此，調(diào)節(jié)神經(jīng)元膽固醇代謝是防治AD的新思路。PC12細(xì)胞是一種常用的神經(jīng)細(xì)胞株，來源于大鼠腎上腺髓質(zhì)分泌兒茶酚胺的嗜鉻細(xì)胞瘤(一種交感神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤)，其胞質(zhì)內(nèi)含有大量嗜鉻顆粒，富含合成及分解多巴胺所需的酶，具有神經(jīng)分泌細(xì)胞和神經(jīng)元的性質(zhì)，且增殖能力強(qiáng)。因此，PC12細(xì)胞被廣泛用于代替神經(jīng)元進(jìn)行研究［2－3］。

近年來銀杏葉提取物被廣泛用于防治AD，取得了較好療效，然而其作用機(jī)制尚未完全闡明。我們前期研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉所含單體銀杏內(nèi)酯B(ginkgolide B，GB)可以有效降低離體培養(yǎng)神經(jīng)元膽固醇含量，提示調(diào)節(jié)腦膽固醇可能是其防治AD的作用機(jī)制之一。然而，機(jī)體外周與中樞之間存在完整的血腦屏障(blood－brain barrier，BBB)，絕大多數(shù)物質(zhì)無法自由通過。因此，離體單獨(dú)干預(yù)神經(jīng)元的效果，很難在體重現(xiàn)。為了驗(yàn)證BBB存在時(shí)GB能否同樣干預(yù)神經(jīng)元膽固醇含量，本研究利用Transwell裝置，將星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte，Ast)和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells，BMECs)共培養(yǎng)，模擬在體BBB環(huán)境，在此環(huán)境下觀察GB對(duì)高膽固醇條件下PC12細(xì)胞膽固醇含量的影響，揭示GB防治AD的潛在作用機(jī)制。

材料和方法

1 細(xì)胞

PC12細(xì)胞株(大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC)。

2 藥品及試劑

DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，馬血清(Gibco)，多聚－L－賴氨酸(Sigma)，MTT試劑盒(購自北京中西泰安技術(shù)服務(wù)有限公司)，可溶性膽固醇(Sigma)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和辛伐他汀均購自Sigma，GB標(biāo)準(zhǔn)品購自寶雞貝斯特植物原料有限公司。其余試劑均為市售分析純。

3 儀器

CO2培養(yǎng)箱(Sanyo)，超凈化工作臺(tái)(日立)，Leica倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀(Lab systems)，高效液相色譜儀(Varian Prostar 210)，高壓泵(Prostar 210)，反相色譜柱(ZORBAX Eclipse XDB －C184.6 ×250 mm，5 μm，Agilent)，紫外檢測器(Varian Prostar 325)，色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(LC Work－station V6.2)。

4 方法

4.1 原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng) 選取2周齡的SD大鼠，脫臼處死，消毒后分離出大腦皮質(zhì)，DMEM培養(yǎng)液漂洗后，將其剪碎、勻漿，再加入0.1%Ⅱ型膠原酶37℃水浴消化30 min，離心、棄上清。加入20%牛血清白蛋白懸浮混勻后離心，加入2 mL 0.1%膠原酶/分散酶懸浮混勻后37℃水浴消化30 min，離心、棄上清，再次加入20%BSA懸浮混勻后離心，即可獲得底部黃白色的“微血管層”。吸取出底部“微血管層”，加入DMEM離心2次，棄上清，加入腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM高糖，20%胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，1 g/L肝素，1 μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，10 μg/L 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，懸浮后接種于涂有明膠的塑料培養(yǎng)瓶中，第2代用于本實(shí)驗(yàn)。

4.2 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)與純化 新生2～3 d Wistar大鼠，脫臼處死，消毒后，取腦，解剖顯微鏡下剝除腦膜，取兩側(cè)大腦皮質(zhì)，D－Hanks液洗2次，剪碎后，0.125%胰酶液37℃消化10 min，終止消化，輕輕吹打，濾網(wǎng)過濾后，1000 r/min離心5 min，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基混懸沉淀，接種入培養(yǎng)瓶中，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min后取出，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，吸取上清液種植于另一預(yù)先涂有L－多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)7～10 d待細(xì)胞分層生長后，置于37℃搖床中250 r/min振蕩24 h，棄上清液，D－Hanks液洗3次，加入0.25%胰酶消化，終止消化后，細(xì)胞懸液1000 r/min離心5 min，棄上清，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基混懸沉淀，接種入預(yù)先涂有L－多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，第2代用于本實(shí)驗(yàn)。

4.3 PC12培養(yǎng)方法 PC12細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清、10%滅活馬血清和1%雙抗(鏈霉素和青霉素)的DMEM培養(yǎng)基中。在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d更換培養(yǎng)液1次，細(xì)胞融合度達(dá)70% ～80%時(shí)，用彎頭吸管適力吹打至細(xì)胞大部分脫落，800 r/min離心5 min，棄上清，完全培養(yǎng)基重懸，1∶3傳代，實(shí)驗(yàn)均取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。

4.4 PC12細(xì)胞膽固醇損傷模型建立 收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)，以5×105/cm2的密度種于事先用L－多聚賴氨酸包被的6孔板中。待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)，將培養(yǎng)有內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的Transwell(孔徑0.45 μm)建成體外BBB模型，并置于培養(yǎng)有PC12細(xì)胞的6孔板內(nèi)。在Transwell內(nèi)皮細(xì)胞側(cè)加入含40 μmol/L終濃度可溶性膽固醇的培養(yǎng)基繼續(xù)作用24 h，作為高膽固醇損傷細(xì)胞模型(3種細(xì)胞的種植方式見圖1)。

Figure 1.Transwell device for BBB model.BMECs:brain microvascular endothelial cells;Ast:astrocytes;PC12:PC12 cells.圖1 Transwell裝置示體外BBB模型示意圖

4.5 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 對(duì)照組(N)，普通培養(yǎng)基培養(yǎng);模型組(M)，40 μmol/L膽固醇處理24 h，更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16 h;西藥對(duì)照組(S)，40 μmol/L膽固醇處理24 h，更換含5 μmol/L辛伐他汀的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16 h;銀杏內(nèi)酯B中劑量組(GB－M)40 μmol/L膽固醇處理24 h，更換含MTT測量的最佳劑量GB的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16 h;銀杏內(nèi)酯B高劑量組(GB－H)，GB用量為5倍于中劑量組，其余同GB－M組;銀杏內(nèi)酯B低劑量組(GB－L)，GB用量為中劑量組的1/5，其余同GB－M組。(注:膽固醇加在Transwell內(nèi)皮細(xì)胞側(cè)，模擬機(jī)體外周膽固醇作用于BBB模型后，進(jìn)而作用于PC12細(xì)胞。)

4.6 MTT比色法確定藥物劑量 將 PC12細(xì)胞以1×105/cm2密度種植于96孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到70% ～80%時(shí)，加入含40 μmol/L膽固醇的完全培養(yǎng)基作用24 h，然后，更換含有梯度濃度銀杏內(nèi)酯B的完全培養(yǎng)基作用16 h。棄上清，無色D－Hanks清洗2～3遍，置換無血清、無酚紅的含0.5 g/L MTT的無色培養(yǎng)基，每孔100 μL，培養(yǎng)箱中作用4 h，棄上清，每孔加入100 μL DMSO作用10 min，充分振蕩后570 nm比色。

4.7 采用高效液相色譜法(high－performance liquid chromatography，HPLC)檢測神經(jīng)元膽固醇含量

4.7.1 細(xì)胞內(nèi)液收集 待細(xì)胞處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3遍。吹打后收集細(xì)胞，將每孔收獲好的細(xì)胞用220 μL裂解液裂解，3000 r/min離心5 min，取上清液用于細(xì)胞內(nèi)膽固醇測定。另將收獲的細(xì)胞用220 μL裂解液裂解，3000 r/min離心5 min，為樣品，用BCA法測定蛋白含量。上清液中加入等體積的新鮮配制的15%KOH醇溶液，室溫渦旋至細(xì)胞溶解產(chǎn)物清亮，加入6%的三氯乙酸去蛋白。再加入等體積的正己烷∶異丙醇4∶1溶液(V/V)，將混合物渦旋5 min，然后1500 r/min離心5 min。收集上層有機(jī)相。將下層水相按上述方法重復(fù)抽提2次。將混合的有機(jī)相在真空冷凍干燥機(jī)中65℃干燥，在室溫冷卻后，加入100 μL異丙醇∶正庚烷∶乙腈35∶12∶52(V/V)，將樣本溶解，活性碳去色素，超聲除氣5 min，1500 r/min 離心 5 min，收集上清液，取 10 μL進(jìn)樣，進(jìn)行高效液相色譜分析。

4.7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取 200、100、20、10、5 mg/L的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液各200 μL，加入50 μL 100 mg/L的豆甾醇內(nèi)標(biāo)液(標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液都用乙醇配制)，混勻，加0.3 mL水、0.5 mL乙醇、1 mL正己烷，混勻 15 min;取有機(jī)相500 μL，50℃揮發(fā)干燥，加入0.4 mL丙酮－硫酸－三氧化鉻溶液，反應(yīng)衍生5 min，加入0.5 mL正己烷終止反應(yīng)，加0.5 mL 水，混勻15 min，取300 μL 揮發(fā)干燥，加300 μL 流動(dòng)相溶解，進(jìn)樣 10 μL。

4.7.3 總膽固醇的測定 取10 μL進(jìn)行蛋白定量，定量后，樣本再進(jìn)行高效液相色譜分析。使用安捷倫HP1100高效液相色譜儀，采用Hypersil1 C18柱，以異丙醇∶乙睛=20∶80為流動(dòng)相進(jìn)行非梯度洗脫，流速1 mL/min，柱溫20℃，DAD檢測波長250 nm。按步驟繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以膽固醇峰和內(nèi)標(biāo)峰面積之比與膽固醇濃度進(jìn)行線性回歸，以回歸方程計(jì)算所測樣品總膽固醇濃度。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件包先進(jìn)行數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，運(yùn)用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)法。方差齊性檢驗(yàn)P＜0.05，表明方差不齊，進(jìn)行兩兩比較時(shí)選用Tamhane's T2檢驗(yàn)，如果方差齊性檢驗(yàn)P＞0.05，則選用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 形態(tài)學(xué)觀察

倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)PC12細(xì)胞接種6 h后可見細(xì)胞呈單層聚集生長，大多細(xì)胞呈圓形、短梭形或三角形，胞漿伸展，細(xì)胞兩極有短突起，細(xì)胞折光性好，胞核可見。隨時(shí)間的延長，72 h細(xì)胞成堆聚集生長明顯，細(xì)胞間沒有空隙，貼壁較松，隨密度的增大可見重疊生長及懸浮生長，見圖2。

Figure 2.Cultured PC12 cells under microscope(×100).圖2 體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞

2 MTT比色實(shí)驗(yàn)選擇GB的給藥濃度

參照文獻(xiàn)用藥資料設(shè)定大致濃度范圍后，采用MTT法檢測細(xì)胞活力，選定最佳A值作為中劑量組濃度，采用其1/5劑量作為低劑量組濃度，采用其5倍劑量作為高劑量組濃度。GB濃度為5 μmol/L時(shí)A值最高，見表1，故本實(shí)驗(yàn)選定GB的干預(yù)劑量為:低劑量 1 μmol/L，中劑量 5 μmol/L，高劑量25 μmol/L。

表1 梯度濃度GB對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響Table 1.The effect of different concentrations of GB on PC12 cell viability(.n=8)

表1 梯度濃度GB對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響Table 1.The effect of different concentrations of GB on PC12 cell viability(.n=8)

*P ＜0.05 vs GB 0 μmol/L group.

0.308 ±0.0701.25 0.329 ±0.0602.5 0.346 ±0.05050.422 ±0.09010 0.422 ±0.030*20 0.420 ±0.040*40 0.418 ±0.05080 0.417 ±0.0300*

3 高效液相色譜法檢測PC12細(xì)胞膽固醇的含量

采用高效液相色譜法檢測不同干預(yù)條件下PC12細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，結(jié)果顯示培養(yǎng)基內(nèi)加入40 μmol/L可溶性膽固醇后，PC12細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量升高，與對(duì)照組相比差異顯著(P ＜0.01)。將不同濃度銀杏內(nèi)酯 B(1 μmol/L、5 μmol/L 和25 μmol/L)加入上述模型中，處理16 h后發(fā)現(xiàn)25 μmol/L GB降膽固醇的效果最佳，與模型組相比差異顯著(P＜0.05)，與陽性對(duì)照藥辛伐他汀組比較沒有顯著差異(P＞0.05)，見表2。

表2 高膽固醇環(huán)境下PC12細(xì)胞膽固醇變化及GB的影響Table 2.The effects of GB and simvastatin on intracellular cholesterol content in PC12 cells exposed to high cholesterol()

表2 高膽固醇環(huán)境下PC12細(xì)胞膽固醇變化及GB的影響Table 2.The effects of GB and simvastatin on intracellular cholesterol content in PC12 cells exposed to high cholesterol()

*P ＜0.05 vs control;＊＊P ＜0.01 vs high cholesterol.

Group n Cholesterol(g/g protein)Control 8 2.29 ±0.26＊＊High cholesterol 8 3.67 ±0.43 High cholesterol+simvastatin 8 2.96 ±0.40*High cholesterol+GB 1 μmol/L 8 3.49 ±0.67 High cholesterol+GB 5 μmol/L 8 3.37 ±0.89 High cholesterol+GB 25 μmol/L 7 3.00 ±0.53*

討 論

膽固醇參與合成激素、構(gòu)成細(xì)胞生物膜，是人體不可或缺的重要成分。適量膽固醇是腦組織合成激素和神經(jīng)遞質(zhì)，維持腦細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。然而，腦膽固醇含量過高也會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元結(jié)構(gòu)受損，功能降低，導(dǎo)致AD等疾病發(fā)生［4－6］。膽固醇代謝與AD發(fā)病機(jī)制的深入研究為治療和預(yù)防AD藥物的開發(fā)提供了一個(gè)新的方向。

從細(xì)胞和分子水平系統(tǒng)、深入研究AD需要建立良好的AD體外模型。以往的研究常采用單獨(dú)原代培養(yǎng)的神經(jīng)元建立模型，該模型雖具代表性和特異性，但因培養(yǎng)系統(tǒng)不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)周期長而使其應(yīng)用受到一定限制。PC12細(xì)胞因具有神經(jīng)元的特性，且增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞特性穩(wěn)定，而被廣泛用于代替神經(jīng)元進(jìn)行研究。另外，單獨(dú)培養(yǎng)的神經(jīng)元無法體現(xiàn)外周與中樞存在血腦屏障的生理環(huán)境。利用Transwell裝置將腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)則解決了體外血腦屏障的問題。本研究中發(fā)現(xiàn)BBB模型建立后，跨膜細(xì)胞電阻(TEER)可以達(dá)到312～340 Ω/cm2時(shí)(本文未顯示)，提示模型建立成功，符合體外BBB標(biāo)準(zhǔn)。

我們前期實(shí)驗(yàn)顯示GB能夠有效降低高膽固醇環(huán)境下PC12細(xì)胞的膽固醇含量，但是基于BBB背景下，外周高膽固醇作用于該模型后，GB對(duì)PC12細(xì)胞是否還具有保護(hù)作用?因此，本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用40 μmol/L終濃度的可溶性膽固醇作用于BBB，成功復(fù)制PC12高膽固醇損傷模型，比較接近在體的內(nèi)環(huán)境，且實(shí)驗(yàn)條件易于控制，是體外進(jìn)行AD 研究的理想模型［3，7－8］。

在銀杏內(nèi)酯中，銀杏內(nèi)酯B的生理活性最強(qiáng)，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的血小板活化因子拮抗劑，同時(shí)對(duì)損傷神經(jīng)元具有保護(hù)作用［9］。德國產(chǎn)的銀杏葉提取物——金納多已經(jīng)用于臨床治療多種疾病，對(duì)神經(jīng)元保護(hù)作用目前頗受重視［10－11］，且臨床證實(shí)對(duì)AD患者有一定療效，故該實(shí)驗(yàn)采用銀杏內(nèi)酯B作為干預(yù)藥物。陽性對(duì)照藥物選擇辛伐他汀，作為羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶競爭性抑制劑，抑制羥甲基戊二酸單酰輔酶A形成，限制膽固醇合成。

本實(shí)驗(yàn)主要采用高效液相色譜法檢測了不同干預(yù)條件下PC12細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，結(jié)果顯示培養(yǎng)基內(nèi)加入高濃度可溶性膽固醇后，細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量升高，提示膽固醇升高可以影響腦膽固醇含量。梯度濃度的銀杏內(nèi)酯B干預(yù)上述模型后，可以不同程度地影響神經(jīng)元膽固醇含量，其中以高劑量組效果最佳，顯示了一定程度的劑量依賴性。提示調(diào)節(jié)腦膽固醇含量可能是銀杏內(nèi)酯B防治AD的機(jī)制之一，為其防治AD提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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