葉冬平，梁偉國，戴麗冰，沈 雁，陳鴻輝

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院第四附屬醫(yī)院，廣州市紅十字會醫(yī)院，廣州市創(chuàng)傷外科研究所，廣東 廣州 510220)

椎間盤退變始于髓核，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是多因素協(xié)同作用的結(jié)果。由于椎間盤在解剖學(xué)和生理學(xué)上具有孤立性和被包裹特征，為椎間盤退變的生物治療(細(xì)胞因子、細(xì)胞移植、基因轉(zhuǎn)染、基因治療)提供有利的條件。椎間盤纖維環(huán)退變制機(jī)與髓核退變相似。由于髓核退變，椎間盤應(yīng)力傳遞不均勻，致使纖維環(huán)應(yīng)力過多聚集某一部位，加劇了纖維環(huán)的退變。本研究根據(jù)前期學(xué)者相關(guān)研究結(jié)果，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real－time qRT－PCR，SYBR Green)技術(shù)，檢測17個(gè)與椎間盤退變相關(guān)的基因［包括合成代謝因子:骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein 7，BMP－7)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白14(bone morphogenetic protein 14，BMP －14)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein 4，BMP －4)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、血小板源性生長因子(platelet－ derived growth factor，PDGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2(bone morphogenetic protein 2，BMP －2)、轉(zhuǎn)化生長因子 β(transforming growth factor β，TGF－β)、胰島素樣生長因子 1(insulin－like growth factor 1，IGF－1)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、金屬蛋白酶1組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase－1，TIMP－1)和 SOX9轉(zhuǎn)錄因子(sex determining region Y－box 9，SOX9);分解代謝因子:基質(zhì)金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinases 3，MMP3)、白細(xì)胞介素－1(interleukin－1，IL－1)和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS);細(xì)胞外基質(zhì):I型膠原α1鏈(collagen type I，alpha 1 chain，COL1A1)、II型膠原 α1 鏈(collagen type II，alpha 1 chain，COL2A1)和聚蛋白多糖(aggrecan)］，研究其在人正常和退變椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞中表達(dá)量的差異，以期探討這些相關(guān)基因與椎間盤退變的關(guān)系，篩選明顯差異基因作為退變纖維環(huán)細(xì)胞體外刺激因子，為生物治療椎間盤退變奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

1.1 細(xì)胞 人正常髓核細(xì)胞，細(xì)胞原代培養(yǎng)標(biāo)本均源自本院因外傷致脊柱爆裂性骨折手術(shù)的患者，共3例，腰1～2椎間盤1例，腰3～4椎間盤2例，手術(shù)均為前側(cè)入路減壓，較完整地取出椎間盤，其中平均年齡32歲。根據(jù)Gries等［1］評分標(biāo)準(zhǔn)，均未見退變。

人退變髓核細(xì)胞，細(xì)胞原代培養(yǎng)標(biāo)本均源自本院因腰椎退行性變手術(shù)的患者，共3例，其中腰3～4椎間盤1例，腰4～5椎間盤2例，平均年齡75歲。根據(jù) Gries等［1］評分標(biāo)準(zhǔn)及磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)，均為重度退變。本研究均征得本人及家屬的知情同意，且通過了廣州市紅十字會醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，青－鏈霉素溶液(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)，0.25%Trypsin和0.02%EDTA溶液(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)，Trizol試劑(Gibco)，0.01 mol/L PBS液(Gibco)，Ⅱ型膠原酶(Sigma)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)、25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning)。

1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo 8000DH)，81－2型恒溫磁力振動攪拌機(jī)(上海司樂儀器廠)，倒置光學(xué)相差顯微鏡(Nikon ECLIPSE Ti－U)，自動平衡離心機(jī)(LDZ4 －0.8)，超凈工作臺(SW－CJ0－ICU)，ABI 3900臺式高通量DNA合成儀(ABI)，科大創(chuàng)新 HC－3018R高速冷凍離心機(jī)，ABI 9700 PCR儀(ABI)，ABI 7500全自動熒光定量PCR儀(ABI)

2 方法

2.1 細(xì)胞分離、培養(yǎng)及傳代 手術(shù)均從后側(cè)入路，能完整取出椎間盤。分離纖維環(huán)組織與髓核組織時(shí)，依靠肉眼、手感等進(jìn)行區(qū)分。纖維環(huán)組織呈白色略硬韌性軟環(huán)狀，用眼科剪充滿阻力，韌性較高。分離清楚后，用含雙抗(青－鏈霉素)的生理鹽水浸泡椎間盤纖維環(huán)組織10 min，雙抗生理鹽水浸泡沖洗3～4次。用眼科剪將纖維環(huán)組織剪成大小為1 mm×1 mm×1 mm大小，放入盛有10 mL 0.2%Ⅱ型膠原酶的100 mL燒杯中，37℃磁力攪拌器攪拌約60 min。待組織完全溶解后，200目的濾網(wǎng)過濾，1000 r/min離心10 min，棄去上液，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基1～2 mL輕輕吹散細(xì)胞，吸至25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基6～8 mL，靜置于37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱中培養(yǎng)3 d。3 d后倒置顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁生長情況，隔天換液。

當(dāng)細(xì)胞接近90%匯合時(shí)進(jìn)行傳代。棄掉培養(yǎng)液，用0.01 mol/L PBS洗滌細(xì)胞2次，棄掉液體。沿瓶壁加入2 mL 0.25%Trypsin+0.02%EDTA溶液，輕晃動培養(yǎng)瓶，鏡下觀察消化情況。鏡下見細(xì)胞皺縮、間隙加大、大部份細(xì)胞變圓漂浮時(shí)立即用含血清的培養(yǎng)液3 mL終止消化;用吸管輕輕吹打細(xì)胞數(shù)次制成細(xì)胞懸液。接種:細(xì)胞懸液1000 r/min離心5 min，棄上清，DMEM培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后按1∶2接種。培養(yǎng)條件同原代培養(yǎng)。

2.2 引物探針設(shè)計(jì)合成 GenBank上查找目的基因mRNA序列，在CDS區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，Primer Express 2.0軟件設(shè)計(jì)引物探針，中山大學(xué)達(dá)安基因股份公司合成，見表1。

2.3 細(xì)胞總RNA的提取 105個(gè)細(xì)胞置于1.5 mL Eppendorf管，加Trizol 1 mL。加入氯仿0.2 mL，蓋緊蓋子，用力搖動15 s，15～30℃孵育2～3 min，4℃ 12000 r/min離心15 min，取上清液至新的1.5 mL Eppendorf管。加與上清液等體積的異丙醇，15～30℃孵育樣品10 min，4℃ 12000 r/min離心10 min，棄上清液，75%乙醇(含DEPC水)洗滌沉淀1次(至少1 mL 75%乙醇/mL Trizol)，4℃ 7500 r/min離心5 min，棄乙醇，空氣或真空干燥5～10 min(不要完全干燥)，加DEPC處理水溶解RNA，－80℃保存?zhèn)溆?。若長期保存，加入2.5倍體積乙醇，置－80℃保存。

2.4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取4 μL RNA模板做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，儀器為ABI 9700儀(ABI)，反應(yīng)體系如下:5×逆轉(zhuǎn)錄 buffer 4μL，下游引物 R(10 μmol/L)0.4 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL，MMLV(2 ×108U/L)1 μL，DEPC 水 10.1 μL，RNA 模板 4 μL，總體積 20 μL。

2.4.1 逆轉(zhuǎn)錄 buffer成分 50 mmol/L Tris－HCl(pH8.0)，50 mmol/L KCl，4 mmol/L MgCl2，10 mmol/L DTT。

2.4.2 反應(yīng)條件 37℃ 1 h，然后95℃ 3 min。

2.5 熒光定量PCR反應(yīng)

2.5.1 陽性標(biāo)準(zhǔn)品及其梯度的制備 標(biāo)準(zhǔn)曲線定量法。h

表1 引物序列和產(chǎn)物長度Table 1.The primers sequences and product pength

2.5.2 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備 預(yù)實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增的陽性產(chǎn)物經(jīng)過2%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳(含溴化乙啶，用TAE緩沖液配制)，在長波紫外下，割下目的條帶。用回收試劑盒(QIA-quick Gel Extraction Kit)回收純化。測定 A260/280＞ 1.8，表明純度合格。用A260測定值和片段長度數(shù)據(jù)換算出濃度(106copies/L)，即為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。

2.5.3 陽性標(biāo)準(zhǔn)品梯度的制備 取陽性標(biāo)準(zhǔn)品5 μL按10倍稀釋(加水45 μL并充分混勻)，依次稀釋下去，制備成陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品梯度，倍比稀釋一定要準(zhǔn)確，否則影響定量結(jié)果。每次上機(jī)必須新鮮配制陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品梯度，正式上機(jī)時(shí)以包含所有樣本的5個(gè)梯度上機(jī)即可。

2.5.4 陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品 采用滅菌雙蒸水。

2.5.5 待測樣本和陽性標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)體系 5×染料PCR buffer 10 μL，上游引物 F(10 μmol/L)1 μL，下游引物 R(10 μmol/L)1 μL，dNTPs(10 mmol/L)1 μL，Taq 酶(3 ×106U/L)1 μL，cDNA 或陽性標(biāo)準(zhǔn)品 5 μL，ddH2O 31 μL，總體積 50 μL。

2.5.6 PCR buffer成分 10 mmol/L Tris－ HCl(pH8.0)，50 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2。

2.5.7 反應(yīng)條件 93℃ 3 min，然后93 ℃ 30 s，55℃ 45 s，共40循環(huán)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 人正常和退變纖維環(huán)細(xì)胞光學(xué)形態(tài)

人正常纖維環(huán)細(xì)胞與退變纖維環(huán)細(xì)胞表形沒有明顯差異，細(xì)胞呈短梭形和長梭形，有明顯的極性;正常纖維環(huán)細(xì)胞較退變纖維環(huán)細(xì)胞胞質(zhì)飽滿，核仁稍大，以短梭形居多;退變纖維環(huán)細(xì)胞較正常纖維環(huán)細(xì)胞生長快，易培養(yǎng)，以長梭形居多，近似成纖維細(xì)胞，見圖1、2。

Figure 1.Human normal AF cells(×200).圖1 人正常纖維環(huán)細(xì)胞

Figure 2.Human degenerative AF cells(×200).圖2 人退變纖維環(huán)細(xì)胞

2 熒光定量PCR結(jié)果

與正常纖維環(huán)細(xì)胞相比，退變纖維環(huán)細(xì)胞TGF－β、IL－1、PDGF和IGF－1 mRNA表達(dá)量降低(P ＜0.01，P ＜0.05);bFGF、TIMP－1、COL1A1和 BMP－14 mRNA 表達(dá)量升高(P＜0.01);正常纖維環(huán)細(xì)胞 aggrecan和BMP－2 mRNA高表達(dá)，退變纖維環(huán)細(xì)胞兩者表達(dá)陰性;COL2A1、iNOS和MMP3在正常纖維環(huán)細(xì)胞mRNA有表達(dá)，在退變纖維環(huán)細(xì)胞表達(dá)陰性;EGF在正常纖維環(huán)細(xì)胞mRNA表達(dá)陰性，在退變纖維環(huán)細(xì)胞有表達(dá)。SOX9、BMP－4和BMP－7在正常和退變纖維環(huán)細(xì)胞mRNA表達(dá)均為陰性，見表2。

表2 正常纖維環(huán)細(xì)胞與退變纖維環(huán)細(xì)胞椎間盤退變相關(guān)基因mRNA的表達(dá)Table 2.The mRNA expression of intervertebral disc degeneration－related genes in normal AF cells and degenerative AF cells(.n=3)

表2 正常纖維環(huán)細(xì)胞與退變纖維環(huán)細(xì)胞椎間盤退變相關(guān)基因mRNA的表達(dá)Table 2.The mRNA expression of intervertebral disc degeneration－related genes in normal AF cells and degenerative AF cells(.n=3)

*P ＜0.05 ，＊＊P ＜0.01 vs normal AF cells.

?

討 論

I型膠原、II型膠原、糖胺多糖基因分析用于衡量椎間盤退變過程中細(xì)胞外基質(zhì)的特征性改變。糖胺多糖和II型膠原mRNA在未退變的髓核細(xì)胞中含量豐富，在退變的髓核細(xì)胞中下降明顯，I型膠原則相反。這3種基因表達(dá)量的改變提示髓核細(xì)胞表型從類軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞。

人椎間盤疾病不僅與其主要基質(zhì)——蛋白多糖和膠原對應(yīng)的基因改變相關(guān)，而且與影響椎間盤基質(zhì)的細(xì)胞因子基因有關(guān)［2－3］。編碼髓核細(xì)胞合成代謝因子的 BMP －2、4、7、14、TGF － β、IGF －1，EGF、PDGF、bFGF 和 SOX9 基因在退變髓核細(xì)胞中下降明顯。在其它肌肉骨骼組織中，這些基因被證實(shí)是創(chuàng)傷過程中促進(jìn)組織愈合、逆轉(zhuǎn)退變過程的始動基因。炎癥調(diào)節(jié)因子如IL－1等可以提高滑膜和軟骨BMP－2、BMP－7 mRNA和蛋白的表達(dá)。這些基因在退變椎間盤髓核細(xì)胞中表達(dá)量明顯下降的機(jī)制尚未明確，但因?yàn)樽甸g盤無血管支配、細(xì)胞數(shù)目較少、免疫豁免等特征，生長因子基因的下調(diào)可能是椎間盤細(xì)胞特有的現(xiàn)象。這一特有現(xiàn)象可能是椎間盤細(xì)胞退變的一種機(jī)制。椎間盤細(xì)胞合成代謝因子基因的明顯下降，提示這些生長因子可以作為基因治療退變椎間盤的候選因子。

生長因子是目前研究最為深入和廣泛的治療椎間盤退變的蛋白質(zhì)，它是通過增加細(xì)胞活性、提高細(xì)胞增殖效率、上調(diào)合成代謝通路等增加蛋白多糖含量。在眾多生長因子中，IGF、FGF、EGF、PDGF等被證實(shí)可以有效提高髓核細(xì)胞的增殖水平［4］。Gruber等［5］報(bào)道，IGF －1 和 FGF 能夠防止椎間盤細(xì)胞凋亡。BMPs家族、TGF－β、生長分化因子5不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖，而且可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)糖胺多糖和Ⅱ型膠原的合成，保持了類軟骨細(xì)胞的表形特征。其它生長因子，如Nell－1(與BMPs家族類似，具有骨形成誘導(dǎo)作用)同樣具有潛在的逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的作用［6］。

1991年Thompson等［4］首先報(bào)道體外培養(yǎng)的髓核細(xì)胞加入外源性生長因子可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖的合成。很多研究已經(jīng)證實(shí)TGF－β1能夠促進(jìn)髓核細(xì)胞外基質(zhì)糖胺多糖和Ⅱ型膠原的表達(dá)。Chen等［7］指出TGF－β1可以持續(xù)刺激人髓核細(xì)胞增殖和蛋白多糖合成。Risbud等［8］最近報(bào)道TGF－β3可以使髓核細(xì)胞和纖維環(huán)細(xì)胞增殖、增加蛋白多糖聚集，效率遠(yuǎn)比TGF－β1高。將外源性細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)因子如:LMP－1、SOX9基因轉(zhuǎn)染入髓核細(xì)胞，可以明顯地增加髓核細(xì)胞外基質(zhì)的糖胺多糖、Ⅱ型膠原的表達(dá)。Zhang等［9］以重組腺病毒為載體比較 BMP 家族各成員(2、3、4、5、7、8、10、11、12、13、14、15)、SOX9 基因等對牛髓核細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響，發(fā)現(xiàn)6 d后BMP－2和BMP－7基因治療組，蛋白多糖的生成明顯高于其它基因治療組。BMP－4和BMP－14基因治療組明顯地增加了膠原的合成。BMP－2基因治療組對髓核細(xì)胞的增殖效果明顯高于其它組。Zhang等［10］同時(shí)也得出轉(zhuǎn)染BMP家族的軟骨細(xì)胞與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)，可以使髓核細(xì)胞分泌更多的蛋白多糖。

TIMP－1是一種細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子。它能特異性與MMPs形成非共價(jià)鍵結(jié)合，阻止MMPs降解細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞外基質(zhì)各種分解酶與其抑制物的失衡可能是椎間盤退變的關(guān)鍵因素。TIMP－1分子與IGF－1、TGF－β、IL－1β等的關(guān)系已經(jīng)有部分學(xué)者進(jìn)行相關(guān)研究［11］。Gunther等［12］顯示TGF－β可以提高TIMP－1在人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的表達(dá)。因此，有學(xué)者認(rèn)為TIMP－1受到生物力學(xué)應(yīng)力的影響大于細(xì)胞因子的影響。Pufe等［13］在成人椎間盤細(xì)胞中增加應(yīng)力，明顯抑制了TIMP－1的生成量。因?yàn)門IMP－1含量在椎間盤退變過程中明顯降低，它有可能是維持椎間盤代謝正平衡的重要調(diào)節(jié)因子，對基因轉(zhuǎn)染治療椎間盤退變帶來一個(gè)新的思路。本實(shí)驗(yàn)示退變纖維環(huán)TGF－β、IL－1 mRNA低表達(dá)，而TIMP－1 mRNA高表達(dá)，其原因有待研究。

SOX9是Ⅱ型膠原合成過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，其在軟骨發(fā)育成熟過程中對Ⅱ型膠原基因COL2A1表達(dá)的增強(qiáng)和促使Ⅱ型膠原合成增加有明確的作用，SOX9基因作為一種翻譯因子基因，受到國內(nèi)外眾多學(xué)者的關(guān)注和研究。退變的人椎間盤細(xì)胞中轉(zhuǎn)染腺病毒介導(dǎo)的SOX9基因，證實(shí)其可以使椎間盤細(xì)胞增殖、II型膠原及蛋白聚糖的合成得到增加［14］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)生長刺激因子都是通過提高SOX9 mRNA的表達(dá)，從而引起COL2A1表達(dá)的增加，相應(yīng)地增加II型膠原及蛋白聚糖的合成［15］。但在本實(shí)驗(yàn)SOX9在正常和退變纖維環(huán)細(xì)胞mRNA表達(dá)陰性，原因有待進(jìn)一步研究。

張小衛(wèi)等［16］通過基因芯片分析人正常和退變頸椎間盤組織基因表達(dá)譜的差異，發(fā)現(xiàn)多種基因表達(dá)異常與頸椎間盤退變相關(guān)，有570個(gè)基因發(fā)生差異表達(dá)，其中上調(diào)550個(gè)，下調(diào)20個(gè)。我們選擇了17個(gè)與椎間盤退變相關(guān)基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究表明:椎間盤纖維環(huán)退變與 TGF－β、IL－1、PDGF、IGF－1、aggrecan和 BMP－2 mRNA 低表達(dá)，bFGF、TIMP －1、BMP －14、COL1A1 mRNA 高表達(dá)相關(guān);退變纖維環(huán)COL1A1 mRNA高表達(dá)與西安大學(xué)醫(yī)學(xué)院對退變頸椎間盤研究結(jié)果一致，提示退變纖維環(huán)細(xì)胞COL1A1蛋白表達(dá)可能增高。根據(jù)本研究結(jié)果BMP－2、TGF－β、PDGF和IGF－1可作為退變纖維環(huán)細(xì)胞體外刺激因子備選，逆轉(zhuǎn)椎間盤退變研究;bFGF、TIMP－1和BMP－14 mRNA高表達(dá)，可能是椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞退變的標(biāo)志物。BMP－2 mRNA在正常纖維環(huán)細(xì)胞高表達(dá)，而退變纖維環(huán)細(xì)胞mRNA表達(dá)陰性;bFGF mRNA在退變纖維環(huán)細(xì)胞表達(dá)明顯高于正常纖維環(huán)細(xì)胞，因此本課題下一步擬用BMP－2和bFGF刺激退變椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞，研究比較這兩種極端表達(dá)因子對纖維環(huán)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。

［1］Gries NC，Berlemann U，Moore RJ，et al.Early histologic changes in lower lumbar disc and facet joints and their correlation［J］.Eur Spine J，2000，9(1):23 －29.

［2］葉 偉，黃東生，劉尚禮，等.IL－6基因單核苷酸多態(tài)性與腰椎間盤疾病的關(guān)聯(lián)研究［J］.中國病理生理雜志，2006，22(4):647 －651.

［3］Noponen －Hietala N，Virtanen I，Karttunen R，et al.Genetic variations in IL－6 associate with intervertebral disc disease characterized by sciatica［J］.Pain，2005，114(1 －2):186－194.

［3］Thompson JP，Oegema TR Jr，Bradford DS.Stimulation of mature canine intervertebral disc by growth factors［J］.Spine，1991，16(3):253 －260.

［5］Gruber HE，Norton HJ，Hanley EN Jr.Anti－ apoptotic effects of IGF－1 and PDGF on human intervertebral disc cells in vitro［J］.Spine，2000，25(17):2153 －2157.

［6］Cowan CM，Jiang X，Hsu T，et al.Synergistic effects of Nell－1 and BMP －2 on the osteogenic differentiation of myoblasts［J］.J Bone Miner Res，2007，22(6):918 －930.

［7］Chen WH，Lo WC，Lee JJ，et al.Tissue－engineered intervertebral disc and chondrogenesis using human nucleus pulposus regulated through TGF－β1 in platelet－rich plasma［J］.J Cell Physiol，2006，209(3):744 －754.

［8］Risbud MV，Di Martino A，Guttapalli A，et al.Toward an optimum system for intervertebral disc organ culture:TGF－β3 enhances nucleus pulposus and anulus fibrosus survival and function through modulation of TGF－β－R expression and ERK signaling［J］.Spine，2006，31(8):884－890.

［9］Zhang Y，An HS，Thonar EJ，et al.Comparative effects of bone morphogenetic proteins and Sox9 overexpression on extracellular matrix metabolism of bovine nucleus pulposus cells［J］.Spine，2006，31(19):2173 －2179.

［10］Zhang Y，Li Z，Thonar EJ，et al.Transduced bovine articular chondrocytes affect the metabolism of cocultured nucleus pulposus cells in vitro:implications for chondrocyte transplantation into the intervertebral disc［J］.Spine，2005，30(23):2601 －2607.

［11］Roberts S，Caterson B，Menage J，et al.Matrix metalloproteinases and aggrecanase:their role in disorders of the human intervertebral disc［J］.Spine，2000，25(23):3005 －3013.

［12］Gunther M，Haubeck HD，van de Leur E，et al.Transforming growth factor β1 regulates tissue inhibitor of metalloproteinases－1 expression in differentiated human articular chondrocytes［J］.Arthritis Rheum，1994，37(3):395 －405.

［13］Pufe T，Lemke A，Kurz B，et al.Mechanical overload induces VEGF in cartilage discs via hypoxia－inducible factor［J］.Am J Pathol，2004，164(1):185 － 192.

［14］Paul R，Haydon RC，Cheng HW，et al.Potential use of Sox9 gene therapy for intervertebral degenerative disc disease［J］.Spine，2003，28(8):755 －763.

［15］Tim YS，Su KK，Li J，et al.The effect of bone morphogenetic protein－2 on rat intervertebral disc cells in vitro［J］.Spine，2003，28(16):1773 －1780.

［16］張小衛(wèi)，郭團(tuán)茂，劉 森，等.人頸椎間盤退變基因表達(dá)譜的研究［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2011，32(3):340 －343，347.