田素民，馬宇昕，孫靈芝，譚 亮，劉 靖，李國營△

(廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院1生理學(xué)教研室，2人體解剖學(xué)教研室，廣東 廣州 510006)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其典型的病理學(xué)特征包括淀粉樣β蛋白(amyloid β －protein，Aβ)沉積形成老年斑，神經(jīng)元細胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)，病因和發(fā)病機制目前仍不明確。Aβ的異常沉積被公認(rèn)為導(dǎo)致AD的最后共同途徑［1］，Aβ持續(xù)損傷神經(jīng)細胞將導(dǎo)致認(rèn)知障礙和行為障礙［2］。近年來，一氧化氮(nitricoxide，NO)作為氣體信號分子參與學(xué)習(xí)記憶的生理和病理過程，引起了研究者們的高度重視。研究表明NO可誘發(fā)長時程增強作用(lone－term potentiation，LTP)這一突觸可塑性及學(xué)習(xí)記憶的主要機制。一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)是體內(nèi)催化生成NO的關(guān)鍵性酶，它的變化即意味著NO的改變。石菖蒲為天南星科多年生草本植物石菖蒲的干燥根莖，具有開竅豁痰、化濕開胃、醒神益智之功效，有研究表明石菖蒲還具有抗癡呆、改善學(xué)習(xí)記憶的功效，是臨床所有抗癡呆、改善記憶的中藥復(fù)方中最常用的單味中藥［3－5］。為研究石菖蒲的抗癡呆、改善學(xué)習(xí)記憶功效的有效部位，及改善Aβ致小鼠認(rèn)知功能損傷的機制，擬采用海馬內(nèi)注射Aβ1－42建立認(rèn)知障礙小鼠模型，觀察石菖蒲不同藥效部位對認(rèn)知功能障礙小鼠大腦勻漿和海馬組織中NOS活性的影響，探討石菖蒲不同提取部位改善Aβ致小鼠認(rèn)知功能障礙是否與NOS機制相關(guān)，為揭示臨床應(yīng)用石菖蒲治療抗老年性癡呆、改善記憶功能的機制提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

Aβ1－42(Anaspec)，石菖蒲 (粵Y20060076，批號20100801，產(chǎn)地山西，廣州市天河寶潤堂中藥飲片廠)，改良型Bradford法蛋白濃度測定試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，NOS測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，萬能粉碎機(FZ－220型，溫嶺市牧嶼百樂機床廠)，循環(huán)水式真空泵(SHZ－DCⅢ，河南省鞏義市英嶼予華儀器廠)，小鼠腦立體定位儀(ST－3ND，成都儀器廠)，Morris水迷宮(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)，石蠟切片機(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備)。

2 方法

2.1 AD動物模型制備及動物分組 健康成年雄性NIH小鼠(9周齡)、體重18～20 g，由廣東省實驗動物中心提供，許可證號SCXK(粵)2008－0002。AD動物模型按如下方法制備:Aβ1－42干粉(500 μg)溶解在含有1%NH4OH 250 μL 的生理鹽水中，混勻，即Aβ1－42溶液濃度稀釋至2 g/L，37℃恒溫箱孵育1周左右，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榫奂瘧B(tài)。小鼠稱重后，用戊巴比妥鈉進行麻醉(50 mg/kg，50 g/L，ip)。用腦立體定位儀取平顱頭位固定小鼠，剪開頭皮，暴露前囟，按小鼠腦立體定位圖譜進行定位［6－7］，在前囟后 2 mm，正中線旁 1.5 mm，顱骨表面下1.9 mm為雙側(cè)海馬CA1注射點。用微量注射器緩慢注入 Aβ1－42，每側(cè)2 μL，進樣速度為 0.8 μL/min。注射完畢，留針5 min后，緩慢退針以防拔針時藥物溢出。術(shù)后骨蠟封口，縫合傷口［8］，連續(xù)3 d肌注青霉素G 8×105U以防感染。

AD模型組動物首先從制備過程順利、出血少、術(shù)后恢復(fù)良好的小鼠中選取。然后，通過水迷宮測試，以生理鹽水模擬注射小鼠和正常小鼠為對照，將認(rèn)知功能有顯著差異的Aβ1－42注射小鼠留作實驗(該模型成功率85.71%)。隨機分為4組:生理鹽水灌胃組、水煎液灌胃組、去油水煎液灌胃組和揮發(fā)油灌胃組，每組6只。

2.2 石菖蒲不同藥效部位的提?。?］藥材經(jīng)鑒定為正品天南星科植物石菖蒲的干燥根莖，藥材打粗粉，過2號篩(20目)。

2.2.1 揮發(fā)油部位 稱取石菖蒲粗粉200 g，加10倍量水，浸泡1 h，加沸石幾粒，水蒸氣蒸餾法提取，至揮發(fā)油不再增多時，停止加熱。測得揮發(fā)油含量1.56% ＞1.0%，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。灌胃前取揮發(fā)油適量，用1% 吐溫－80稀釋100倍備用。

2.2.2 去油水煎液部位 收集提取揮發(fā)油后的石菖蒲殘渣，經(jīng)真空泵過濾，濾液濃縮至200 mL(1∶1)。

2.2.3 水煎液部位 石菖蒲粗粉200 g，加10倍量的水，浸泡1 h，回流提取1 h，殘渣用1000 mL水進行煎煮。合并2次濾液，低溫濃縮至200 mL，即為石菖蒲水煎液(1∶1)。

2.3 AD模型小鼠灌胃給藥 生理鹽水灌胃組(作為石菖蒲灌胃的對照組，0.25 mL/10 g BW)、水煎液灌胃組(0.2 mL/10 g BW)、去油水煎液灌胃組(0.2 mL/10 g BW)和揮發(fā)油灌胃組(0.2mL/10 g BW)，連續(xù)灌胃3周。

2.4 水迷宮測驗 Morris水迷宮包括小鼠行為學(xué)測試系統(tǒng)、圖像自動監(jiān)視處理系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理分析系統(tǒng)。水池直徑120 cm，高60 cm，平臺直徑12 cm，水溫(25±2)℃。(1)定位航行實驗:所有小鼠進行隱藏平臺實驗，歷時5 d，每天定時訓(xùn)練4次，將小鼠依次從4個指定的標(biāo)記點，面向池壁放入水中［10］，記錄小鼠在1 min內(nèi)尋找平臺所需時間 (逃避潛伏期)。在每個時間段的訓(xùn)練中，如小鼠在1 min內(nèi)成功爬上平臺，記錄下其所需的時間，并允許它們在平臺上呆30 s，然后結(jié)束該次訓(xùn)練。如果小鼠在1 min內(nèi)未能找到平臺，將其引導(dǎo)到平臺上，并停留30 s，逃避潛伏期記錄為1 min。逃避潛伏期越長，代表小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力越差。(2)空間探索室驗:第6 d撤出平臺，任選1個入水點將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠在1 min內(nèi)進入原平臺象限的時間。

2.5 組織樣品處理及檢測 小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(50 mg/kg，50 g/L，ip)，斷頭處死，迅速于冰盒上取大腦或剝出完整的海馬，將組織置于冰冷的生理鹽水中漂洗，濾紙吸干，稱重，制成10%大腦勻漿和10%海馬勻漿。3000 r/min離心15 min，取上清液。采用考馬斯亮藍測定法測定組織中蛋白含量，分光光度法測定組織中NOS含量。具體操作均按照試劑盒說明書進行。

2.6 免疫組織化學(xué)方法檢測腦組織中NOS的表達 小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(50 mg/kg，50 g/L，ip)，施行左心室－主動脈灌注，先用0.9%生理鹽水快速沖洗血液，繼之，用含4%多聚甲醛的0.1 mol/L的磷酸緩沖液(PBS，pH 7.4，4℃)繼續(xù)灌注，待充分固定后，迅速取材腦組織，并置于上述相同固定液中4℃后固定過夜。NOS免疫組化染色具體步驟如下:切片常規(guī)脫蠟至水，浸入0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)微波修復(fù)20 min。冷卻后用3%過氧化氫室溫孵育30 min以滅活內(nèi)源性酶。5%BSA室溫30 min。每張切片加1∶100 NOS抗體，4℃過夜。生物素化山羊抗兔IgG室溫孵育40 min。SABC室溫孵育30 min。DAB顯色，陽性顯色為棕黃色。各步驟間PBS(pH 7.4)洗滌3次。蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片后光學(xué)顯微鏡進行觀察。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。組間比較采用單因素方差分析ANOVA，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 水迷宮測驗

4組AD模型小鼠(生理鹽水灌胃組、水煎液灌胃組、去油水煎液灌胃組和揮發(fā)油灌胃組)空間探索實驗結(jié)果顯示，與生理鹽水灌胃組相比，灌服石菖蒲不同藥效部位(水煎液和揮發(fā)油)的2個組60 s內(nèi)跨越平臺的次數(shù)和在目標(biāo)象限的探索時間都明顯增加，差異顯著(P＜0.05)，去油水煎液灌胃組有改善但無顯著差異，見表1。

表1 4組小鼠空間探索比較Table 1.Comparison of spatial performance of mice in the four groups(.n=6)

表1 4組小鼠空間探索比較Table 1.Comparison of spatial performance of mice in the four groups(.n=6)

*P ＜0.05 vs AD plus saline group.

Group Frequencies of across platform in 60 s Swimming time in target quadrant(s)AD plus saline 2.250 ±0.510 16.705 ±0.771 AD plus decoctum 4.011 ±1.414* 26.145 ±0.770*AD plus decoctum without oil 3.018 ±1.414 20.085 ±0.516 AD plus essential oil 5.015 ±0.021* 22.110 ±0.665*

2 石菖蒲不同藥效部位對AD模型小鼠大腦組織NOS活性的影響

與生理鹽水灌胃模型組相比，灌服石菖蒲不同藥效部位的3組AD模型小鼠大腦組織NOS活性均有降低。其中，揮發(fā)油灌胃組與生理鹽水灌胃組相比小鼠大腦NOS活性有顯著差異(P＜0.05)，見表2。

3 石菖蒲不同藥效部位對AD模型小鼠海馬組織NOS活性的影響

灌服石菖蒲不同藥效部位的3組AD模型小鼠海馬組織NOS活性均明顯降低。與生理鹽水灌胃相比，石菖蒲不同藥效部位灌胃3組小鼠海馬NOS活性均有顯著差異(P＜0.01)，見表3。

表2 各組小鼠大腦NOS活性Table 2.NOS activity in the mouse cerebrum in each group(.n=6)

表2 各組小鼠大腦NOS活性Table 2.NOS activity in the mouse cerebrum in each group(.n=6)

*P ＜0.05 vs AD plus saline group.

AD plus saline 1.124 ±0.119 AD plus decoctum 1.106 ±0.455 AD plus decoctum without oil 0.933 ±0.066 AD plus essential oil 0.467 ±0.074*

表3 各組小鼠海馬NOS活性Table 3.NOS activity in the hippocampus of mice in each group(.n=6)

表3 各組小鼠海馬NOS活性Table 3.NOS activity in the hippocampus of mice in each group(.n=6)

＊＊P ＜0.01 vs AD plus saline group.

AD plus saline 1.180 ±0.036 AD plus decoctum 0.750 ±0.021＊＊AD plus decoctum without oil 0.755 ±0.163＊＊AD plus essential oil 0.624 ±0.040＊＊

4 免疫組織化學(xué)檢測

棕黃色的陽性產(chǎn)物分布于胞膜和胞漿，胞核不著色。陽性細胞多分布在海馬、齒狀回和皮質(zhì)，正常組海馬NOS陽性神經(jīng)元以錐體細胞為主，模型組則以圓形細胞為主。灌服石菖蒲不同藥效部位的3組和生理鹽水灌胃組相比，陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，染色程度變淺，尤其是揮發(fā)油組(P＜0.05)，見圖1。免疫組織化學(xué)的定性和定量結(jié)果與上述NOS活性的檢測結(jié)果基本一致，見圖2。

討 論

學(xué)習(xí)和記憶屬于腦的高級功能，是認(rèn)知活動的重要方面。評價動物認(rèn)知功能的常用方法之一是學(xué)習(xí)記憶行為測試。Morris水迷宮可以檢測與海馬功能直接相關(guān)的空間學(xué)習(xí)記憶的形成和維持時間，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)研究領(lǐng)域。Morris水迷宮的空間探索實驗用于檢測動物保持記憶的能力。本研究Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示，AD+石菖蒲不同藥效部位灌胃組的小鼠和其對照組相比，前者在目標(biāo)象限的探索時間和60 s內(nèi)跨越平臺的次數(shù)均有增加。其中水提液灌胃組和揮發(fā)油灌胃組對小鼠認(rèn)知功能的改善最為明顯，與對照組相比差異顯著。這表明石菖蒲揮發(fā)油組和水煎液組對學(xué)習(xí)記憶的改善作用更佳，這就意味著在這2組提取液中含有對改善學(xué)習(xí)記憶功能更有效的藥效成分，這為進一步研發(fā)抗老年性癡呆的藥物提供了科學(xué)依據(jù)。

Figure 1.After mice were treated with different fractions of Acori graminei rhizome，NOS expression in the brain was shown.A1，A2:AD plus saline group;B1，B2:AD plus decoctum group;C1，C2:AD plus decoctum without oil group;D1，D2:AD plus essential oil group.Scale bar=100 μm.圖1 各組小鼠灌服石菖蒲不同藥效部位后，NOS在腦組織中的表達

Figure 2.Comparison of IA of NOS positive cells in mouse brain tissues..n=6，*P＜0.05 vs AD plus saline group.圖2 各組小鼠腦組織內(nèi)NOS陽性細胞IA的比較

NO是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞間的氣體信號分子，與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、成熟、學(xué)習(xí)記憶等密切相關(guān)。海馬LTP被認(rèn)為是突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶的主要機制［1，11］。NO從突觸后釋放，通過擴散作用于突觸前神經(jīng)末梢及膠質(zhì)細胞，提高自發(fā)的小規(guī)模興奮性突觸后電位，誘發(fā)LTP［1］。NO對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病生理病理的關(guān)鍵作用已經(jīng)明確，既具有潛在的保護作用，又有神經(jīng)毒性作用［12］。正常情況下，神經(jīng)元合成和釋放適量的NO，參與導(dǎo)向軸突生長、促進遞質(zhì)釋放、參與突觸可塑性。但若NOS持續(xù)增加，NO釋放過多，則會誘發(fā)細胞毒性作用，從而導(dǎo)致細胞受損，加速神經(jīng)元凋亡或死亡［13］。也有研究表明過多NO的毒性作用會導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙［14］。目前普遍認(rèn)為NO對AD的神經(jīng)毒性作用已遠遠超過了其保護作用［1］。從本實驗對石菖蒲不同部位灌服后，其生化檢測和免疫組織化學(xué)檢測的結(jié)果來看，石菖蒲不同藥效部位對大腦和海馬內(nèi)NOS總的影響是降低NOS活性。但結(jié)果也表明石菖蒲不同藥效部位灌胃后，對記憶功能和NOS活性的影響是不同的。其中揮發(fā)油和水提液灌胃組對AD模型小鼠認(rèn)知功能的改善、NOS活性的降低效果最為顯著。這和以往研究結(jié)果有所不同，以往認(rèn)為，石菖蒲改善認(rèn)知功能的藥效部位主要在揮發(fā)油成分，而本研究的結(jié)果提示，在石菖蒲的水溶性成分中，含有同樣重要的藥效成分，或重要的藥效協(xié)同成分，這和前述的Morris水迷宮實驗結(jié)果是一致的。就石菖蒲改善學(xué)習(xí)記憶能力的NOS機制來看，可能是由于水提液灌胃組、揮發(fā)油活性和去油水煎液灌胃后抑制了NOS的合成，使大腦和海馬內(nèi)源性NO合成釋放隨之較少，可使神經(jīng)元誘發(fā)和維持LTP，增強突觸傳遞效應(yīng)，通過這種機制改善學(xué)習(xí)記憶能力。也可能與石菖蒲能調(diào)節(jié)某些神經(jīng)遞質(zhì)的釋放去影響NO的合成釋放，從而促進學(xué)習(xí)記憶能力的恢復(fù)有關(guān)。石菖蒲不同藥效部位在體內(nèi)的作用很可能存在復(fù)雜過程和機制。本研究僅從NOS角度做了初步探討，更深入和確切的機制還需進一步研究。

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