李 超，劉善紅，張家明，劉 敏，李景東

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430022)

甲狀腺素所致心肌肥厚的動物模型其血流動力學(xué)表現(xiàn)為心率加快、心輸出量增加、心肌收縮力增強(qiáng)及舒張期縮短，而上述病理生理變化都涉及心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放和重吸收平衡的改變。研究表明:甲狀腺素通過改變心肌細(xì)胞膜上的L型－鈣離子通道(L－type Ca2+channels，LTCCs)、肌漿網(wǎng)膜(sarcoplasmic reticulum，SR)上的Ca2+釋放通道即蘭尼堿受體2(ryanodine receptors，RyR2)、鈣 ATP酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+－ATPase 2a，SERCA2a)與受磷蛋白(phospholamban，PLB)等通道蛋白的表達(dá)和活性，來影響SR 內(nèi) Ca2+釋放和重吸收平衡［1］;而 RyR2、SERCA2a、PLB 及LTCCs等上述通道蛋白均受Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin－dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)的直接調(diào)節(jié)，過度表達(dá)CaMKⅡ的小鼠將引起心臟的結(jié)構(gòu)和電重構(gòu)［2］，提示心肌細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ與心肌肥厚、心律失常和心力衰竭的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。作為參與細(xì)胞內(nèi)Ca2+調(diào)控的重要信號分子，CaMKⅡ激活是否受甲狀腺素的影響，CaMKⅡ是否參與長期甲狀腺素刺激誘導(dǎo)的甲亢性心臟病的發(fā)生發(fā)展，目前國內(nèi)外缺乏這方面的研究。本研究利用長期甲狀腺素刺激致大鼠心肌肥厚模型，觀察心肌CaMKⅡ的變化，為探討CaMKⅡ是否參與長期甲狀腺素刺激誘導(dǎo)的甲亢性心臟病的發(fā)生發(fā)展提供實驗依據(jù);進(jìn)而有可能用CaMKⅡ抑制劑來治療甲亢性心臟病。

材料和方法

1 材料

1.1 動物模型制備及分組 健康雄性SD大鼠20只，購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，體重為180～210 g(196.5 g±7.3 g)。將SD大鼠隨機(jī)分為甲狀腺素刺激組和對照組，每組各10只，以0.2 mg·kg－1·d－1的劑量腹腔注射甲狀腺素或等體積生理鹽水3個月(每次給藥前稱體重)，均以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

1.2 試劑 甲狀腺素粉劑、SDS、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris堿(Sigma);大豆胰蛋白酶抑制劑(Amresco);BCA法試劑盒(Pierce);ECL發(fā)光試劑盒(Amersham);兔抗GAPDH抗體、山羊抗 CaMKⅡδ(A－17)抗體(Santa Cruz);兔抗CaMKⅡ(Thr286)抗體(Cell Signaling);辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)Ⅱ抗均購自武漢安特捷生物技術(shù)有限公司;Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司;其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。所用引物由大連寶生物工程有限公司根據(jù)設(shè)計合成。

2 方法

2.1 心肌肥厚和纖維化測定 以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，麻醉成功后仰臥位固定于動物手術(shù)臺上，沿胸骨左緣開胸迅速取出心臟，用PBS洗凈殘血、沿室間隔分離左右心室肌后，濾紙吸干后稱重并記錄心臟各部分重量。取部分左室中段橫截面心肌，常規(guī)制片后行HE染色，在顯微鏡下放大400倍拍照，每張切片隨機(jī)選取10個視野，每個視野選10個心肌細(xì)胞測量其橫徑大小并取其平均值反映心肌肥厚;常規(guī)制片后行Masson染色，在顯微鏡下心肌細(xì)胞呈紫紅色，膠原纖維呈藍(lán)色，采用Image－Pro Plus 6.0彩色病理圖文分析系統(tǒng)在膠原組織Masson三色染色下測量心肌血管周圍膠原面積(perivascular collagen area，PVCA)和血管腔面積(vascular luminal area，VA)，以PVCA/VA作為心肌纖維化指標(biāo)，每一標(biāo)本取6條壁內(nèi)小動脈橫切面進(jìn)行測量，取其平均值反映心肌纖維化程度。

2.2 用實時定量RT－PCR法檢測心肌組織中CaMKⅡ mRNA的表達(dá) 利用Trizol法提取心肌組織中總RNA，然后通過常規(guī)反轉(zhuǎn)錄－擴(kuò)增法檢測目的基因mRNA的表達(dá)。CaMKⅡ上游引物5'－AGAAGTTCAAGGCGACCAGCA －3'，下游引物5'－GGGTATCCCACCAGCAAGATGTAG－3';內(nèi)參照基因GAPDH上游引物5'－CTATCGGCAATGAGCGGTTC－3'，下游引物5'－CTTAGGAGTTGGGGGTGGCT－3'。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA后，取適量的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)條件:50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s，64 ℃ 15 s，72 ℃45 s，共40個循環(huán)，72℃ 10 min。以熔解曲線和產(chǎn)物電泳結(jié)果判斷反應(yīng)產(chǎn)物特異性。依據(jù)公式 ΔCt=Ct目的基因－Ct內(nèi)參照基因求得兩組ΔCt，根據(jù)實時定量PCR原理，待擴(kuò)增目的基因的Ct值與該基因的拷貝數(shù)呈反比，ΔCt值越大表明基因表達(dá)量越低，用2－ΔΔCt的方法求得CaMKⅡ mRNA的相對含量。

2.3 心肌組織中CaMKⅡ的表達(dá)與活性的檢測 取左室游離壁心肌組織100 mg左右剪碎，放入勻漿器中，加入1 mL裂解液(50 mmol/L Tris－HCl pH 7.5，100 mmol/L KCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，0.1 mmol/L PMSF，50 mmol/L NaF，50 mmol/L β －磷酸甘油，20 mmol/L焦磷酸鈉，1 mmol/L LR微囊藻素，20 mg/L大豆胰蛋白酶抑制劑，5 mg/L亮肽素)充分勻漿，4℃12000×g離心15 min，取上清分裝后置于－70℃保存。BCA法測定蛋白濃度后，每組取適量等量蛋白(約60 μg)加上樣緩沖液，PCR儀99℃10 min，使蛋白充分變性。采用9%SDS聚丙烯酰胺電泳(SDS－PAGE)分離(100 V，120 min)蛋白，硝酸纖維素膜電轉(zhuǎn)印(300 mA，70 min)，麗春紅S液染膜，0.3%TBST液洗膜3 min×3次，5%脫脂奶粉封閉3 h后加入山羊抗CaMKⅡδ(A －17)抗體1∶200、兔抗 CaMKⅡ(Thr286)抗體 1∶500、兔抗GAPDH抗體1∶1000于4℃孵育過夜，TBST洗膜15 min×3次后加入相應(yīng)Ⅱ抗，室溫下孵育2 h，TBST洗膜15 min×3次(CaMKⅡ磷酸化蛋白的Ⅰ抗和Ⅱ抗洗膜7 min×3次)，DAB顯色，用圖像分析系統(tǒng)(Gel－Pro Analyzer 4.0)對蛋白條帶進(jìn)行半定量分析，用平均灰度值代表蛋白表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 一般情況觀察

甲狀腺素刺激組造模3～7 d后大鼠開始出現(xiàn)食欲及活動明顯增強(qiáng)、煩躁不安、心率加快、體重增長速度減慢等表現(xiàn)。造模3個月后實驗組大鼠體重增加81.5 g±12.3 g，對照組大鼠體重增加248.5 g±14.2 g，差異顯著(P＜0.05)。

2 2組心肌肥厚和心肌纖維化程度比較

從圖1和圖2中可以明顯看出實驗組大鼠心肌纖維橫徑比對照組明顯增粗，并且左室心肌纖維化程度明顯增加。甲狀腺素刺激組大鼠的心重、心重/終體重、左心室重/終體重、左室心肌細(xì)胞橫徑及左室心肌纖維化程度(PVCA/VA)分別是正常組的1.17倍、1.87倍、1.84倍、2.15倍和1.94倍，見表1。

Figure 1.The comparison of left ventricular myocardial fiber diameter size(HE staining，× 400).A:control;B:hyperthyroid.圖1 左室心肌纖維橫徑大小的比較

Figure 2.The comparison of left ventricular myocardial fibrosis(Masson staining，× 400).A:control;B:hyperthyroid.圖2 左室心肌纖維化程度的比較

3 定時定量RT－PCR結(jié)果

甲狀腺素刺激組和對照組心肌細(xì)胞中CaMKⅡmRNA的相對表達(dá)量分別為0.28±0.19和1.60±0.45，甲狀腺素刺激組心肌細(xì)胞中CaMKⅡmRNA表達(dá)量是對照組的40%，差異顯著(P ＜0.05)，見圖3。

表1 體重、心重及心肌細(xì)胞橫徑與心肌纖維化的變化Table 1.The changes of BW，HW，HW/BW，LVW/BW，myocardial cell diameter and myocardial fibrosis(.n=10)

表1 體重、心重及心肌細(xì)胞橫徑與心肌纖維化的變化Table 1.The changes of BW，HW，HW/BW，LVW/BW，myocardial cell diameter and myocardial fibrosis(.n=10)

*P ＜0.05 ，＊＊P ＜0.01 vs control group.IBW:initial body weight;FBW:final body weight;HW:heart weight;LVW:left ventricular weight;MCD:myocardial cell diameter.

PVCA/VA Control 197.00 ±7.15 445.50 ±19.21 1.16 ±0.11 Group IBW(g) FBW(g) HW(g) HW/FBW(mg/g)LVW/FBW(mg/g) MCD(μm)2.61 ±0.14 1.90 ±0.14 53.76 ±11.00 1.68 ±0.38 Hyperthyroid 196.00 ±7.38 277.50 ±15.32＊＊ 1.36 ±0.11* 4.90 ±0.31* 3.49 ±0.21＊＊ 115.37 ±48.00＊＊ 3.27 ±0.66*

Figure 3.The relative expression level of CaMKⅡ mRNA in the two groups..n=10.*P＜0.05 vs control.圖3 2組CaMKⅡmRNA相對表達(dá)水平

4 心肌組織中CaMKⅡ蛋白表達(dá)與活性的變化

從圖4A可看出甲狀腺素刺激組與對照組心肌均有CaMKⅡ的表達(dá)，實驗組的CaMKⅡδ總蛋白的條帶較對照組淡和窄，而其磷酸化蛋白的條帶較對照組則明顯增寬變深;圖4B為CaMKⅡδ(A－17)總蛋白和CaMKⅡ(Thr286)磷酸化蛋白表達(dá)半定量分析。CaMKⅡδ(A－17)總蛋白:0.35±0.01與0.28±0.05，甲狀腺素刺激組CaMKⅡδ總蛋白表達(dá)水平僅為對照組的79%;CaMKⅡ(Thr286)磷酸化蛋白:0.26±0.02與0.40±0.03，差異為1.58倍，兩者差異顯著(P＜0.05)。

Figure 4.The protein expression of CaMK Ⅱδ(A －17)and CaMK Ⅱ(Thr286).1～4:hyperthyroid;5～6:control..n=10.*P＜0.05 vs control.圖4 CaMKⅡδ(A－17)和CaMKⅡ(Thr286)的表達(dá)

討 論

本研究發(fā)現(xiàn):長期甲狀腺素刺激致心肌肥厚可降低心肌CaMKⅡ的表達(dá)，但其CaMKⅡ的活性卻增加，說明CaMKⅡ在甲亢性心臟病的發(fā)展中的發(fā)生了重要改變。甲狀腺素是維持機(jī)體新陳代謝、生長發(fā)育中具有重要作用的內(nèi)分泌激素，心肌肥厚是甲狀腺功能亢進(jìn)所致心肌損害的嚴(yán)重并發(fā)癥，其血流動力學(xué)表現(xiàn)為心率加快、心輸出量增加、心肌收縮力增強(qiáng)及舒張期縮短［3］。在慢性甲狀腺素刺激誘導(dǎo)甲亢性心臟病時，甲狀腺素通過何種途徑參與心肌損害的發(fā)生發(fā)展，其具體發(fā)生機(jī)制仍不太明確。目前研究認(rèn)為以下途徑可能參與甲亢性心臟病的發(fā)生發(fā)展:(1)甲狀腺素通過甲狀腺素受體(thyroid hormone receptors，TRs)結(jié)合到細(xì)胞染色體上，調(diào)控靶基因的調(diào)節(jié)區(qū)域，從而影響其相應(yīng)靶基因的表達(dá)(即經(jīng)典基因調(diào)控機(jī)制)，如甲狀腺素誘導(dǎo)β－肌球蛋白重鏈(β－myosin heavy chain，β－MHC)向 α－肌球蛋白重鏈(α－myosin heavy chain，α－MHC)亞型的轉(zhuǎn)換、增加 SR膜上 RyR2和SERCA2a的表達(dá)、降低PLB的表達(dá)及上調(diào)β－腎上腺素受體(β －adrenergic receptor，β － AR)等［1］;(2)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(即非基因調(diào)控機(jī)制)，如甲狀腺素可激活 MAPK、mTOR/AKT、ERK等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促使心肌細(xì)胞及心肌纖維增殖肥大，并且抗細(xì)胞增殖藥物雷帕霉素可抑制甲狀腺素所致心肌肥厚［4－6］;同時也有研究表明:長期甲狀腺素刺激的大鼠可增加其血液和組織中的腎素和血管緊張素Ⅱ(angiotensin，AngⅡ)水平以及激活機(jī)體交感腎上腺系統(tǒng)，但甲狀腺素使心肌組織中腎素和AngⅡ水平升高不依賴β－AR激活以及血液中腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)(renin－angiotensinaldosterone system，RAAS)的激活，交感神經(jīng)拮抗劑或雙腎切除術(shù)都無法阻止甲狀腺素所致心肌肥厚［7］，提示有其它信號機(jī)制參與甲亢性心臟病發(fā)生發(fā)展。

CaMKⅡ是Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶的成員之一，目前研究發(fā)現(xiàn)CaMKⅡ在心臟中有細(xì)胞核型CaMKⅡδB和胞漿型CaMKⅡδC兩種不同的剪接體，前者主要參與基因的表達(dá)調(diào)控，而后者主要參與Ca2+依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［8］。過度表達(dá)CaMKⅡδC小鼠會引起心腔明顯擴(kuò)大、心肌功能障礙、細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡及猝死［8］;而過度表達(dá)CaMKⅡδB的心肌細(xì)胞有明顯的肥大，而抑制CaMKⅡ活性及表達(dá)可減輕心肌肥大、改善心功能及降低惡性心律失常甚至猝死的發(fā)生［8－9］;大量研究表明慢性轉(zhuǎn)基因抑制 CaMKⅡ或CaMKⅡ抑制劑KN－93均可減輕心肌對慢性β－AR刺激的反應(yīng)［10］。提示心肌細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ在心肌肥厚、心律失常和心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中起著重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用［11］。CaMKⅡ的激活包括鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)依賴性激活和非CaM依賴性的氧化激活。前者與β－AR和α－AR信號系統(tǒng)激活密切相關(guān)，機(jī)體交感腎上腺系統(tǒng)激活導(dǎo)致胞漿內(nèi)Ca2+濃度(［Ca2+］i)增加，當(dāng)［Ca2+］i水平升高時，Ca2+與 CaM 結(jié)合，后者結(jié)合到CaMKⅡ的調(diào)節(jié)域，改變激酶的構(gòu)象，激活CaMKⅡ;而當(dāng)［Ca2+］i降低時，CaMKⅡ自身抑制區(qū)和催化域相結(jié)合，阻止底物和Mg2+/ATP結(jié)合到酶的催化中心，使其激酶處于自身抑制的無活性狀態(tài)［10，12］。非CaM依賴性的氧化激活途徑與CaMKⅡ調(diào)節(jié)域內(nèi)甲硫氨酸殘基Met281/282的氧化有關(guān)，Met281/282的氧化可以阻止催化域與調(diào)節(jié)域的抑制性結(jié)合，引起激酶構(gòu)象改變，從而激活CaMKⅡ［13］。研究發(fā)現(xiàn)，用H2O2處理的Jurkat細(xì)胞在沒有Ca2+的情況下可通過活性氧介導(dǎo)機(jī)制激活CaMKⅡ［14］。

甲狀腺素如何影響心肌細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ的表達(dá)和活性，其具體發(fā)生機(jī)制尚無定論，但相關(guān)研究提示兩者之間相互影響。Jiang等［15］研究表明短期(7 d)甲狀腺素降低兔心肌CaMKⅡ的表達(dá)和活性，值得提出的是:該模型并沒有提到造成了兔心肌肥大;另外，大劑量短期(14 d)甲狀腺素(1 mg·kg－1·d－1)皮下注射也未導(dǎo)致狗心肌肥大［16］;因而對甲亢性心臟病時CaMKⅡ表達(dá)和活性的改變尚不清楚的。甲狀腺素增加心肌SR膜上SERCA2a和RyR2通道的表達(dá)和活性，同時降低心肌SR膜上PLB的表達(dá)及活性，減少PLB對SERCA2a的抑制效應(yīng)，上述效應(yīng)將明顯提高SR內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運速度，導(dǎo)致單位時間內(nèi)Ca2+在胞漿內(nèi)滯留間期縮短，引起CaMKⅡ的CaM依賴性激活能力下降［1］，從生理意義上講，心肌內(nèi)CaMKⅡ表達(dá)下降是機(jī)體平衡甲狀腺素使SR內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運能力增強(qiáng)的一種生理性適應(yīng);同時也有研究表明:甲狀腺素誘導(dǎo)兔骨骼肌的β－MHC向α－MHC的轉(zhuǎn)換過程中，其肌纖維中CaMKⅡ全酶的構(gòu)成亞基及含量存在著差異并可能與CaMKⅡ表達(dá)及活性下降有關(guān)［17－18］。我們的研究發(fā)現(xiàn):在慢性甲狀腺素刺激誘導(dǎo)心肌肥厚模型中，甲狀腺素降低心肌CaMKⅡ的表達(dá)，但其CaMKⅡ的活性卻增加，但其具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究證實。其原因可能與下面因素有關(guān):(1)長期甲狀腺素刺激可增加大鼠血液和心肌組織中的腎素和AngⅡ水平［7］，導(dǎo)致其心肌 CaMKⅡ的活性升高;(2)長期甲狀腺素刺激引起機(jī)體交感腎上腺系統(tǒng)過度亢進(jìn)，蛋白激酶A(protein kinases A，PKA)過磷酸化可使活性狀態(tài)下的RyR與FK506結(jié)合蛋白12.6(FK506 bindingproteins 12.6，F(xiàn)KBP12.6)解離，同時上調(diào)心肌SR膜上PLB的表達(dá)，增加PLB對SERCA2a的抑制效應(yīng)［19］，降低SR內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運速度，當(dāng)上述效應(yīng)強(qiáng)于甲狀腺素使SR內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運能力增強(qiáng)時，將導(dǎo)致心肌舒張期胞漿內(nèi)［Ca2+］i升高，從而引起CaMKⅡ激活;(3)長期甲狀腺素刺激引起心肌無氧代謝增強(qiáng)，心肌存在過度氧化應(yīng)激可能使CaMKⅡ的非CaM依賴性的氧化激活途徑增強(qiáng)。由于活性增加的CaMKⅡ可導(dǎo)致心肌肥大［9］，我們的研究提示:在慢性甲狀腺素刺激誘導(dǎo)甲亢性心臟病時，可以考慮應(yīng)用CaMKⅡ抑制劑來抑制心肌肥厚和心肌纖維化。

［1］Arai M，Otsu K，MacLennan DH，et al.Effect of thyroid hormone on the expression of mRNA encoding sarcoplasmic reticulum proteins［J］.Circ Res，1991，69(2):266－276.

［2］Zhang T，Brown JH.Role of Ca2+/calmodulin－dependent protein kinaseⅡin cardiac hypertrophy and heart failure［J］.Cardiovasc Res，2004，63(3):476 －486.

［3］Fazio S，Palmieri EA，Lombardi G，et al.Effects of thyroid hormone on the cardiovascular system［J］.Recent Prog Horm Res，2004，59(1):31 －50.

［4］Kinugawa K，Jeong MY，Bristow MR，et al.Thyroid hormone induces cardiac hypertrophy in a thyroid hormone receptor α1－ specific manner that requires TAK1 and p38 mitogen － activated protein kinase［J］.Mol Endocrinol，2005，19(6):1618 －1628.

［5］Cao X，Kambe F，Moeller LC，et al.Thyroid hormone induces rapid activation of Akt/protein kinase B－mammalian target of rapamycin－p70S6K cascade through phosphatidylinositol 3 － kinase in human fibroblasts［J］.Mol Endocrinol，2005，19(1):102 －112.

［6］Kuzman JA，O'connell TD，Gerdes AM.Rapamycin prevents thyroid hormone － induced cardiac hypertrophy［J］.Endocrinology，2007，148(7):3477－3484.

［7］Kobori H，Ichihara A，Suzuki H，et al.Role of the renin－angiotensin system in cardiac hypertrophy induced in rats by hyperthyroidism［J］.Am J Physiol，1997，273(2 Pt 2):H593－H599.

［8］Zhang R，Khoo MS，Wu Y，et al.Calmodulin kinaseⅡinhibition protects against structural heart disease［J］.Nat Med，2005，11(4):409－417.

［9］Zhang T，Maier LS，Dalton ND，et al.The δCisoform of CaMKⅡis activated in cardiac hypertrophy and induces dilated cardiomyopathy and heart failure［J］.Circ Res，2003，92(8):912－919.

［10］Wang W，Zhu W，Wang S，et al.Sustained β1－adrenergic stimulation modulates cardiac contractility by Ca2+/calmodulin kinase signaling pathway［J］.Circ Res，2004，95(8):798－806.

［11］鐘擁軍，陳東芹，姚小燕.CaMKⅡ抑制劑抑制AngⅡ或電場刺激誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞TNF－α、TGF－β1及collagenⅠ、Ⅲ的表達(dá)［J］.中國病理生理雜志，2010，26(8):1549－1554.

［12］Couchonnal LF，Anderson ME.The role of calmodulin kinase Ⅱ in myocardial physiology and disease［J］.Physiology，2008，23(3):151－159.

［13］Erickson JR，Joiner MA，Guan X，et al.A dynamic pathway for calcium－independent activation of CaMKⅡby methionine oxidation［J］.Cell，2008，133(3):462 －474.

［14］Howe CJ，Lahair MM，McCubrey JA，et al.Redox regulation of the calcium/calmodulin dependent protein kinases［J］.J Biol Chem，2004，279(43):44573－44581.

［15］Jiang M，Xu A，Narayanan N.Thyriod hormone downregulates the expression and function of sarcoplasmic reticulum－associated CaM kinaseⅡin the rabbit heart［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，291(3):H1384 －H1394.

［16］Hoey A，Page A，Brown L，et al.Cardiac changes in experimental hyperthyroidism in dogs［J］.Aust Vet J，1991，68(11):352－355.

［17］Damiani E，Sacchetto R，Margreth A.Phosphorylation of anchoring protein by calmodulin protein kinase associated to the sarcoplasmic reticulum of rabbit fast－twitch muscle［J］.Biochem Biophys Res Commun，2000，279(1):181－189.

［18］Sacchetto R，Damiani E，Pallanca A，et al.Coordinate expression of Ca2+－ATPase slow－twitch isoform and of β calmodulin－dependent protein kinase in phospholamban－deficient sarcoplasmic reticulum of rabbit masseter muscle［J］.FEBS Lett，2000，481(3):255 －260.

［19］Marx SO，Reiken S，Hisamatsu Y，et al.PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel(ryanodine receptor):defective regulation in failing hearts［J］.Cell，2000，101(4):365 －376.