朱曉芳，王曉冰，陳培榮，嘉 婷，朱小春

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，浙江 溫州 325000)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種病因未明的累及多系統(tǒng)的慢性反復(fù)性自身免疫疾病。SLE病人與動物模型中干擾素γ(interferon－gamma，IFN－γ)的表達增加是導(dǎo)致疾病發(fā)展的重要機制之一［1－2］。三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)是中藥砒霜的主要成分，已成功應(yīng)用于急性早幼粒細胞白血病及一些實體腫瘤的臨床治療［3］。國外研究［4］及我們的前期研究［5－6］均證實ATO是一種治療SLE很有前景的藥物，但其具體機制尚待進一步研究。本文通過運用染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)方法研究ATO對狼瘡鼠IFN－γ基因表達的調(diào)控，為ATO治療SLE的作用機制提供重要的實驗依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑和器材 ATO、植物血凝素P(phytohemagglutinin－P，PHA－P)和37%的甲醛(252549)購自Sigma;抗RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ，RNAP II)抗體、ChIP試劑盒(#17－371)購自Millipore;乙?；M蛋白H4(acH4)抗體(ab15823)和乙?；M蛋白H3(acH3)抗體(ab10812)購自Abcam;重組人白細胞介素－2(interleukin－2，IL－2)購自上海華新生物高技術(shù)有限公司;RPMI－1640和胎牛血清(FCS)購自Gibco;小鼠淋巴細胞分離液(北京索萊寶);Trizol購自 Invitrogen;RT－PCR試劑盒、SYBR Green real－time PCR試劑盒購自Toyobo;小鼠IFN－γ ELISA試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司;超聲波細胞破碎儀JY92－Ⅱ購自寧波新芝;熒光定量PCR儀采用ABI的StepOne Plus Real－Time PCR System。實驗中所用引物由Invitrogen合成。

1.2 動物 20周齡 MRL/lpr狼瘡鼠15只，體重36～38 g;20周齡 C57BL/6J小鼠 28只，體重20～22 g，購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心，飼養(yǎng)在溫州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心SPF級動物房。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)與實驗分組 頸椎脫臼法處死小鼠后，無菌條件下取脾臟，用200目篩網(wǎng)輕輕研磨脾臟過濾成單細胞懸液，采用密度梯度離心法自脾臟單細胞懸液中分離小鼠淋巴細胞，用10%FCS－RPMI－1640重懸，調(diào)整細胞濃度為2×109/L，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)1～2 h后觀察細胞生長情況，排除細菌生長，臺盼藍染色法測定細胞存活率＞98%。加入PHA－P(終濃度20 mg/L)和IL－2(終濃度106IU/L)，孵箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h后隨機分為2組:(1)PBS組:為空白對照組;(2)ATO 組:1.0 μmol/L ATO 作為實驗組，共同培養(yǎng)24 h。

2.2 ELISA法測定各組培養(yǎng)上清液IFN－γ的濃度 收集細胞懸液于Eppendorf管，離心后吸取細胞上清液置于－80℃冰箱保存待測。嚴格按試劑說明書操作，顯色后在全自動酶標儀上450 nm波長處讀取A值，通過繪制標準曲線求出指標含量。

2.3 實時熒光定量PCR法檢測各組細胞IFN－γ mRNA的表達 用Trizol法抽提RNA，測RNA濃度后取2 μg的RNA，采用日本東洋紡(Toyobo)的 RT－PCR試劑盒，依照說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以β－actin為內(nèi)參照，采用實時熒光定量PCR進行IFN－γ和β－actin產(chǎn)物擴增及結(jié)果分析。IFN－γ引物序列:上游為5'－ggaaccctctcccttcaatgt－3';下游為5'－ctccacaatagccttcagtgc－3'。β－actin引物序列:上游為5'－gagaccttcaacaccccagc－3';下游為 5'－atgtcacgcacgatttccc－3'。反應(yīng)體系:SYBR－Green Master Mix 10 μL，Plus 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL，DNA 模板 2 μL，加滅菌雙蒸水補至總體積20 μL。PCR循環(huán)條件設(shè)置:94℃變性10 min后，94℃ 20 s，60℃ 1 min，擴增50個循環(huán)，反應(yīng)完成后再于95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s繪制熔解曲線。根據(jù)Livak和Schmittgen設(shè)計的閾值法測定目的基因的相對表達水平，目的基因量 =2－ΔΔCt，將 C57BL/6J小鼠PBS組(C57 PBS)作為樣本校正，其表達水平設(shè)置為1，ΔΔCt = ［Ct目的基因(其它實驗組)－Ct內(nèi)參照(其它實驗組)］－［Ct目的基因(C57 PBS)－ Ct內(nèi)參照(C57 PBS)］。

2.4 ChIP 主要步驟:(1)蛋白－DNA交聯(lián)和裂解細胞:取10 mL細胞懸液(約2×107個細胞)，加入37%甲醛使之終濃度為1%，37℃孵育10 min。加入甘氨酸終止交聯(lián)反應(yīng)，洗滌2次。離心去上清后加入1 mL含蛋白酶抑制劑的SDS裂解液重懸細胞沉淀，冰上孵育10 min。(2)超聲斷裂染色質(zhì):按優(yōu)化好的條件(200 W，每次超聲15 s，間隔30 s，共10次)斷裂細胞裂解液中的染色質(zhì)，使DNA的長度主要分布在200～1000 bp，4℃離心保留上清。(3)免疫共沉淀:超聲處理后的溶液中加入含蛋白酶體抑制劑的ChIP稀釋緩沖液，用蛋白G－瓊脂糖小珠進行預(yù)清除，離心后吸取1%上清留作input溶液，將剩余的上清分裝，每管1.0 mL，分別加入特異性抗體(抗 RNAPⅡ抗體每管 5.0 μg，抗 acH3 抗體每管 3 μg，抗 acH4 抗體每管 2.5 μg)及陰性對照抗體(正常小鼠IgG每管1.0μg)，4℃搖床上孵育過夜。第2 d溶液中加入蛋白G－瓊脂糖小珠吸附免疫沉淀復(fù)合物，離心去上清，依次用低鹽、高鹽、氯化鋰和TE緩沖液清洗蛋白G－瓊脂糖小珠。(4)洗脫免疫沉淀復(fù)合物:配制新鮮洗脫液用于洗脫免疫沉淀復(fù)合物，同時在裝有Input溶液的管中加入相同體積的洗脫緩沖液。(5)蛋白－DNA復(fù)合物解交聯(lián):加入5 mol/L NaCl使之終濃度為0.02 mol/L，65℃水浴孵育過夜。(6)用DNA純化柱回收DNA。

2.5 半定量PCR分析ChIP產(chǎn)物 半定量PCR分析ChIP產(chǎn)物，用于擴增IFN－γ基因啟動子的引物如下:上游引物為5'－tcagctgatcctttggaccc－3'，下游引物為5'－ctcagagctaggcgcagg－3'。反應(yīng)體系:10×PCR buffer 2 μL、2 mmol/L dNTP 2 μL、25 mmol/L MgSO40.8 μL、上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL、KOD Plus 0.4 μL、DNA 模板 2 μL，加滅菌雙蒸水補至總體積 20 μL。PCR循環(huán)條件設(shè)置:94℃變性3 min后，94℃ 20 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，擴增32個循環(huán)，然后行72℃ 2 min。最后將PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳。

2.6 實時熒光定量PCR分析ChIP產(chǎn)物 實時熒光定量PCR分析ChIP產(chǎn)物，用于擴增的IFN－γ基因啟動子引物如下:上游為 5'－tttcagagaatcccacaagaatg－3'，下游為5'－tcgggattacgtattttcacaag－3'。采用ABI公司的StepOne Plus Real－Time PCR System對CHIP產(chǎn)物分析，反應(yīng)體系:SYBR－green master mix 10 μL、Plus 2 μL、上下游引物(10μmol/L)各 1 μL、DNA模板 2 μL，加滅菌雙蒸水補至總體積20 μL。PCR循環(huán)條件設(shè)置:94℃變性10 min后，94℃20 s，60℃ 1 min，擴增50個循環(huán)，反應(yīng)完成后再于95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s繪制熔解曲線，分析方法參考文獻［7］和ChampionChIP qPCR Primers說明書介紹的方法，用ΔΔCt值進行相對定量，各實驗組均以C57BL/6J小鼠PBS組(C57 PBS)為對照組，其表達水平設(shè)置為1，計算其它實驗組較對照組C57 PBS組的倍數(shù)改變。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

以SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準()表示，進行方差齊性檢驗，根據(jù)樣本的性質(zhì)采用單因素方差分析、Dunnet's T3檢驗。以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ELISA法測定上清液中IFN－γ濃度的結(jié)果

(1)MRL/lpr狼瘡鼠PBS組IFN－γ的分泌高于C57BL/6J小鼠PBS組(P＜0.01);(2)在 MRL/lpr狼瘡鼠中，與PBS組相比，ATO組IFN－γ的分泌下降(P＜0.01);(3)在 C57BL/6J小鼠中，PBS組和ATO組之間IFN－γ的濃度無差異，見表1。

表1 MRL/lpr小鼠和C57BL/6J小鼠細胞上清液中IFN－γ的濃度Table 1.The expression of IFN － γ in the supernatants of the cells from MRL/lpr mice and C57BL/6J mice(ng/L..n=6)

表1 MRL/lpr小鼠和C57BL/6J小鼠細胞上清液中IFN－γ的濃度Table 1.The expression of IFN － γ in the supernatants of the cells from MRL/lpr mice and C57BL/6J mice(ng/L..n=6)

＊＊P ＜0.01 vs MPL/lpr PBS group.

PBS 273.005 ±18.824 168.462 ±11.779＊＊ATO 191.731 ±16.522＊＊ 160.914 ±14.526＊＊

2 超聲波斷裂染色質(zhì)

按優(yōu)化好的條件(200 W，每次超聲15 s，間隔30 s，共10次)斷裂細胞裂解液中的染色質(zhì)，切割后的DNA片段主要分布在200～1000 bp，基本符合ChIP的要求，見圖1。

Figure 1.The segments of crosslinked DNA cut by ultrasound were mainly 200 ～1000 base pairs in size.圖1 超聲波切割染色質(zhì)DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

3 半定量PCR分析ChIP結(jié)果

半定量PCR分析各組細胞IFN－γ啟動子區(qū)acH3、acH4及啟動子區(qū)結(jié)合RNAPⅡ的水平。超聲打斷之后，以各組input DNA為模板，以IFN－γ為引物，通過調(diào)整模板量，重復(fù)驗證以最后在各組的input DNA擴增出相同條帶時的模板量作為最后抗體處理過的DNA樣本做PCR所需的模板量，并且將PCR產(chǎn)物稀釋2倍，瓊脂糖凝膠電泳顯示。與正常C57BL/6J小鼠相比，MRL/lpr狼瘡鼠脾臟淋巴細胞IFN－γ啟動子區(qū)acH3和acH4的水平升高，更多的RNAPⅡ被富集到IFN－γ啟動子區(qū)域;ATO能降低MRL/lpr狼瘡鼠脾臟淋巴細胞IFN－γ基因啟動子區(qū)域acH3和acH4的水平，減弱RNAPⅡ與IFN－γ啟動子區(qū)域的結(jié)合，而對正常C57BL/6J小鼠無明顯影響，見圖2。

4 實時熒光定量PCR分析ChIP結(jié)果及IFN－γ mRNA的表達情況:

Figure 2.Identification of ChIP by semiquantitative PCR and agarose gel electrophoresis.圖2 半定量PCR驗證ChIP的瓊脂糖凝膠電泳圖

(1)MRL/lpr狼瘡鼠PBS組IFN－γ mRNA的表達高于C57BL/6J小鼠PBS組(P＜0.05)，并且IFN－γ啟動子區(qū)acH3、acH4的水平及啟動子區(qū)域富集RNAPⅡ水平高于 C57BL/6J小鼠 PBS組(均 P＜0.01);(2)在 MRL/lpr狼瘡鼠中，與 PBS組相比，ATO組IFN－γ mRNA的表達下降(P＜0.05)，IFN－γ基因啟動子區(qū)域acH3、acH4的水平及啟動子區(qū)域富集RNAPⅡ水平也下降(均P＜0.01);(3)在C57BL/6J小鼠中，PBS組和ATO組之間以上指標均無差異，見圖3。

Figure 3.All samples were divided and analyzed by quantitative real－time PCR －based ChIP to measure the degree of histones H3(A)and H4(B)acetylation at IFN－γ promoter regions and the combination of RNA polymeraseⅡto IFN －γ promoter(C).Quantitative real－time PCR was also used to measure the levels of IFN－γ mRNA(D)..n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs each other.圖3 實時熒光定量PCR分析ChIP結(jié)果及IFN－γ mRNA的表達

討 論

SLE是一種常見的自身免疫性疾病，其病因和發(fā)病機制尚未完全闡明。處于活動期的SLE病人全血細胞中IFN－γ的分泌量明顯高于正常人，并且分泌水平與SLEDAI(SLE活動性指標)呈不同程度的正相關(guān)［1］。Hasegawa等［2］認為循環(huán)和組織 IFN － γ的表達增加是導(dǎo)致SLE疾病發(fā)展和腎臟損害的重要機制。越來越多的研究表明下調(diào)IFN－γ水平可作為治療 SLE 的新靶點［8－9］。Bobe 等［4］提出:ATO 能下調(diào) MRL/lpr狼瘡鼠血清 IFN－γ的水平，減少MRL/lpr小鼠皮膚損害和腎小球免疫復(fù)合物的沉積，極大地延長生存時間。這與我們的前期體內(nèi)研究［5－6］相一致。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)1.0 μmol/L ATO體外作用MRL/lpr狼瘡鼠24 h是最佳作用時間和作用濃度。本研究發(fā)現(xiàn)，L/lpr狼瘡鼠脾臟淋巴細胞IFN－γ的分泌水平及其mRNA的表達高于正常C57BL/6J小鼠;ATO能下調(diào)MRL/lpr狼瘡鼠脾臟淋巴細胞IFN－γ的分泌水平及其 mRNA的表達，而對正常C57BL/6J小鼠無明顯影響。ATO通過何種機制下調(diào)MRL/lpr狼瘡鼠IFN－γ mRNA的表達，從而降低IFN－γ的分泌水平是本研究的重點。

組蛋白乙?；揎検腔蜣D(zhuǎn)錄調(diào)控的重要機制。當組蛋白乙?；缴邥r，染色質(zhì)處于活化或開放狀態(tài)，此時核小體之間的致密度很低，允許了轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的進入，從而導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄，反之，則阻止了基因的轉(zhuǎn)錄［10－11］。Long 等［12］發(fā)現(xiàn)組蛋白的高乙?；菍?dǎo)致IFN－γ基因轉(zhuǎn)錄表達量增加的主要機制，而組蛋白的乙酰化水平下降時，IFN－γ基因轉(zhuǎn)錄表達量也下調(diào)。ChIP是一種能真實反映細胞內(nèi)DNA結(jié)合蛋白與基因組DNA相互作用的實驗技術(shù)，目前常用于研究組蛋白修飾，轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)調(diào)控復(fù)合物與 DNA的相互作用［13］。本研究運用ChIP技術(shù)發(fā)現(xiàn)MRL/lpr狼瘡鼠脾臟淋巴細IFN－γ啟動子區(qū)acH3、acH4的水平較正常C57BL/6J小鼠升高，ATO能降低MRL/lpr狼瘡鼠脾臟淋巴細胞IFN－γ基因啟動子區(qū)域acH3和acH4的水平，而對正常C57BL/6J小鼠無明顯影響。我們由此推測，MRL/lpr狼瘡鼠脾臟淋巴細胞高表達IFN－γ mRNA可能與其基因啟動子區(qū)域acH3、acH4的水平升高有關(guān)，而ATO可能通過下調(diào)IFN－γ啟動子區(qū)域acH3、acH4的水平，阻礙了轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的進入，從而阻止IFN－γ基因的轉(zhuǎn)錄，減少IFN－γ mRNA的表達。

RNAPⅡ與相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子組成mRNA的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體在基因的轉(zhuǎn)錄中起著重要的作用［14］。在ChIP應(yīng)用抗RNAPⅡ抗體，了解RNAPⅡ與基因啟動子區(qū)結(jié)合情況，能較好地反映mRNA的轉(zhuǎn)錄情況:轉(zhuǎn)錄激活時RNAPⅡ與基因啟動子區(qū)域的結(jié)合水平升高，反之，二者結(jié)合水平下降［15］。本研究發(fā)現(xiàn)與正常C57BL/6J小鼠相比，更多的RNAPⅡ被富集到MRL/lpr狼瘡鼠脾臟淋巴細胞IFN－γ的啟動子區(qū)域，ATO能減弱MRL/lpr狼瘡鼠RNAPⅡ與IFN－γ啟動子區(qū)域的結(jié)合，而對正常C57BL/6J小鼠無明顯影響。因此，ATO可能通過減弱MRL/lpr狼瘡鼠RNAPⅡ與IFN－γ啟動子區(qū)域的結(jié)合而阻止IFN－γ基因的轉(zhuǎn)錄。

綜上所述，通過MRL/lpr狼瘡鼠這個模型我們可以推測ATO可能通過下調(diào)MRL/lpr狼瘡鼠IFN－γ基因啟動子區(qū)域acH3和acH4的水平，減弱RNAPⅡ依賴的轉(zhuǎn)錄，從而降低IFN－γ mRNA的表達，下調(diào)IFN－γ的分泌水平。但ATO對轉(zhuǎn)錄因子如STAT4、T－bet以及組蛋白的其它修飾仍待進一步研究。

［1］Lit LC，Wong CK，Tam LS，et al.Raised plasma concentration and ex vivo production of inflammatory chemokines in patients with systemic lupus erythematosus［J］.Ann Rheum Dis，2006，65(2):209 －215.

［2］Hasegawa K，Hayashi T，Maeda K.Promotion of lupus in NZB×NZWF1mice by plasmids encoding interferon(IFN)－γ but not by those encoding interleukin(IL)－4［J］.Comp Pathol，2002，127(1):1 －6.

［3］任瑋瑋，李 弘，張 洹.三氧化二砷對肝癌細胞生長抑制作用差異性探討［J］.中國病理生理雜志，2004，20(7):1179 －1182.

［4］Bobé P，Bonardelle D，Benihoud K，et al.Arsenic tri oxide:a promising novel therapeutic agent for lymphoproliferative and autoimmune syndromes in MRL/lpr mice［J］.Blood，2006，108(13):3967 －3975.

［5］王曉冰，陳培榮，張 挺，等.三氧化二砷對MRL/lpr狼瘡鼠IFN－γ、IL－4表達和Th1/Th2平衡的影響［J］.細胞生物學(xué)雜志，2008，30(4):509 －514.

［6］Xia XR，Xu H，Zhu XC.Effects of arsenic trioxide on survival rate and autoimmune responses of lupus mice［J］.Chin J Pharmacol Toxicol，2007，21(6):482 －486.

［7］Pace BS，Qian XH，Sangerman J，et al.p38 MAP kinase activation mediates γ－globin gene induction in erythroid progenitors［J］.Exp Hematol，2003，31(11):1089 －1096.

［8］Lawson BR，Prud'homme GJ，Chang Y，et al.Treatment of murine lupus with cDNA encoding IFN － γR/Fc［J］.J Clin Invest，2000，106(2):207 －215.

［9］Shirota H，Gursel M，Klinman DM.Suppressive oligodeoxynucleotides inhibit Th1 differentiation by blocking IFN－ γ and IL －12 － mediated signaling［J］.J Immunol，2004，173(8):5002 －5007.

［10］Backs J，Olson EN.Control of cardiac growth by histone acetylation/deacetylation［J］.Circ Res，2006，98(1):15－24.

［11］Urnov FD，Wolffe AP.Chromatin remodeling and transcriptional activation:the cast(in order of appearance)［J］.Oncogene，2001，20(24):2991 －3006.

［12］Long M，Slaiby AM，Wu S，et al.Histone acetylation at the Ifng promoter in tolerized CD4 cells is associated with increased IFN－γ expression during subsequent immunization to the same antigen［J］.J Immunol，2007，179(9):5669－5677.

［13］李敏俐，王 薇，陸祖宏.ChIP技術(shù)及其在基因組水平上分析DNA與蛋白質(zhì)相互作用［J］.遺傳，2010，32(3):219－228.

［14］Sims RJ3rd，Belotserkovskaya R，Reinberg D.Elongation by RNA polymerase II:the short and long of it［J］.Genes Dev，2004，18(20):2437 －2468.

［15］Sandoval J，Rodríguez JL，Tur G，et al.RNAPol－ ChIP:a novel application of chromatin immunoprecipitation to the analysis of real－time gene transcription［J］.Nucleic Acids Res，2004，32(11):e88.