李杏肖，李曉紅，林秋雄，肖定璋，劉曉穎，單志新，朱杰寧，麥麗萍，夏慧蘇，余細(xì)勇

(廣東省心血管病研究所，廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東 廣州 510080)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)有較高的端粒酶活性［1］，具有自我更新和多向分化潛能。在一定環(huán)境下可轉(zhuǎn)變生成心肌細(xì)胞，移植時不會引起免疫排斥反應(yīng)［2］，對人體來講是相對安全的［3］。因此，探索用BMSCs修復(fù)損傷的心肌組織，重建新生血管，為缺血性心臟病治療帶來新的希望。體外實(shí)驗(yàn)證明，在心臟發(fā)生和多能心臟祖細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞系、內(nèi)皮細(xì)胞系和平滑肌細(xì)胞系的過程中，LIM(Lin－11、Isl－1和Mec－3)同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子Islet 1(insulin transcription factor 1，Isl1)發(fā)揮著十分重要的作用［4－6］。Moretti等［7］進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，Isl1+心臟祖細(xì)胞可分化為心肌細(xì)胞。

將未分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞直接移植入體內(nèi)，其將自主分化為多種細(xì)胞類型，并可形成畸形瘤。為了避免畸形瘤的形成，在移植前，干細(xì)胞必須分化為特定的細(xì)胞系。另外，目前研究表明，單一條件下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成肌分化率并不高。因此，本研究采用微環(huán)境和轉(zhuǎn)錄因子Isl1聯(lián)合應(yīng)用的策略觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的能力，為基因治療提供進(jìn)一步的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。

材料和方法

1 主要試劑

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長完全培養(yǎng)基購于Cyagen，按說明書配制，4℃ 保存;DMEM/F12培養(yǎng)基購于HyClone;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購于Gibco。Polybrene和 puromycin購于 Sigma;Standard Transwell Insert購于 Corning。新生 SD乳鼠(1～3 d)購自廣州市白云區(qū)龍歸嶺南科研動物養(yǎng)殖場。Trizol購于Molecular Research Center;GoTap? Green Master Mix購于 Promega;PrimeScriptTMRT Reagen Kit及SYBR? Premix Ex TaqTM購于 TaKaRa。GAPDH(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，磷酸甘油醛脫氫酶)、心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)、心肌肌鈣蛋白 I(cardiac troponin I，cT-nI)、α－輔肌動蛋白(α－actinin)和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的Ⅱ抗均購于Sant Cruz;FITC(fluorescein isocyanate，異氰酸熒光素)標(biāo)記Ⅱ抗購于Invitrogen;Isl1蛋白抗體購于Proteintech Group;二脒基苯基吲哚(4，6－diamidino－2－ phenylindole，DAPI)購于 Sigma。

2 方法

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)采用骨穿法獲取人體骨髓，聯(lián)合應(yīng)用差速貼壁法和密度梯度離心法分離獲得BMSCs。樣本置于人BMSCs生長完全培養(yǎng)基(Cyagen)中，于37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h后更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁細(xì)胞，此時貼壁細(xì)胞即為BMSCs。當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%融合時即可進(jìn)行傳代。

2.2 穩(wěn)定細(xì)胞株BMSC－isl1的制備及鑒定 本實(shí)驗(yàn)采用慢病毒LVS－isl1(廣州賽業(yè)生物科技有限公司制備)感染 BMSCs。感染時，加入8 mg/L polybrene。感染后第2 d，換液(不含 polybrene)。感染后第3 d，開始穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選(0.5 mg/L puromycin)，10～12 d后即可形成抗puromycin的穩(wěn)定表達(dá)Isl1的細(xì)胞株，命名為BMSC－isl1。攜帶EGFP但不攜帶Isl1的慢病毒感染BMSCs，篩選獲得的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，命名為BMSC－vehicle。

獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株后，RT－PCR檢測BMSC－isl1中Isl1 mRMA的表達(dá)水平;Western blotting檢測BMSC－isl1中Isl1蛋白表達(dá)水平。

引物序列:Isl1正義鏈 5'－GCTCGTCGTCGACAACGGCTC－3'，反義鏈 5'－CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC－3';β－actin正義鏈5'－GCGAATGTTTCCGCTGTGTAG －3'，反義鏈 5'－AGCTTACAAAGGCGACACATC －3'。

2.3 乳鼠心肌細(xì)胞的分離、培養(yǎng) 新生1～3 d SD乳鼠，取出心臟，加入0.25%胰酶反復(fù)消化至組織塊消化完全，2500 r/min離心10 min，去上清。用培養(yǎng)基將沉淀的細(xì)胞重懸并轉(zhuǎn)入至培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 h后顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)，將未貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)入Transwell小室(直徑為0.4 μm)中培養(yǎng)。

2.4 模擬心肌微環(huán)境的非接觸共培養(yǎng) BMSCs和乳鼠心肌原代細(xì)胞用Transwell小室以1:10的比例共培養(yǎng)，下層分別種植BMSCs、BMSC－vehicle或者BMSC－isl1，上層種植乳鼠心肌原代細(xì)胞。加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱，隔天換液。

2.5 Isl1的調(diào)控能力考察 共培養(yǎng)1周結(jié)束后，觀察BMSCs分化為心肌樣細(xì)胞的能力，并在mRNA水平和蛋白水平進(jìn)行檢測。(1)Real－timePCR檢測心臟特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白4(GATA－binding protein 4，GATA4)、NK2 轉(zhuǎn)錄因子 5(NK2 transcription factor related，locus 5，NKx2.5)和肌細(xì)胞增強(qiáng)因子 2C(myocyte enhancer factor 2C，MEF2C)，以及心肌特性基因蘭尼堿受體2(ryanodine receptor 2，RyR2)mRNA表達(dá)水平;(2)Western blotting檢測心肌特異性蛋白cTnT的表達(dá);(3)免疫熒光檢測心肌特異性蛋白α－actinin和cTnI的表達(dá)。

引物序列:GATA4正義鏈 5'－GCTGGAGCTCAAGGAGACTC －3'，反義鏈 5'－TACTGATTTTCCAGCCATTTCA－3';Nkx2.5正義鏈 5'－GCTCCCAACATGACCCTGAG－3'，反義鏈 5'－ TGCCCATGGACTCTCGGAG－3';MEF2C正義鏈5'－ATATCATTGGCGTATGGCAC －3'，反義鏈 5'－ AAAAAGCCACAAATGCTTTG－3';RyR2正義鏈 5'－TACCAG-CAAGCCCGACTC －3'，反義鏈 5'－ACCTTGAGAGCAACGAGGAA－3';β－actin正義鏈5'－GCCAACACAGTGCTGTCTG －3'，反義鏈 5'－TACTCCTGCTTGCTGATCCA －3'。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 穩(wěn)定細(xì)胞株BMSC－isl1的鑒定

慢病毒感染BMSCs后，從mRNA水平和蛋白水平兩個層面對細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。RT－PCR和Western blotting結(jié)果均顯示，BMSCs、BMSC－vehicle中無Isl1的表達(dá)，BMSC－isl1組Isl1有較高表達(dá)，見圖1。表明已成功獲得過表達(dá)Isl1的穩(wěn)定細(xì)胞株BMSC－isl1。

Figure 1.Identification of stable BMSC －isl1 cell line.Representative RT－PCR(A)and Western blotting assays(B)of Isl1 are shown.BMSCs were maintained in human MSC complete medium and transfected with LVS－isl1 when cells reached 70%confluence.After 48 h，BMSCs were treated with puromycin(2 mg/L).After 7～10 d treatment of puromycin，cells were harvested and total RNA and cell lysates were subject to RT － PCR and Western blotting assays，respectively.圖1 BMSC－isl1中Isl1 mRNA及蛋白的表達(dá)

2 共培養(yǎng)1周后檢測Isl1的調(diào)控能力

Real－time PCR檢測結(jié)果顯示(圖2)，BMSCs組和BMSC－vehicle組相比，心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA4、Nkx2.5和MEF2C，以及心肌特異蛋白RyR2 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。BMSC－isl1組心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA4、Nkx2.5和MEF2C，以及心肌特異蛋白RyR2 mRNA的表達(dá)較之BMSCs組和BMSC－vehicle組均有提高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。

Figure 2.Effects of Isl1 on BMSC differentiation tested by examining the mRNA expression of GATA4，Nkx2.5，MEF2C and RyR2.BMSCs，BMSC－vehicle and BMSC－isl1 stable cell line were co－cultured with neonatal rat ventricular myocytes for 1 week.The cells were collected and total RNA was subject to real－time PCR analysis..n=3.*P＜0.05 vs BMSCs or BMSC －vehicle.圖2 微環(huán)境中Isl1對BMSCs分化能力的影響

Western blotting檢測結(jié)果顯示(圖3)，BMSCs組和BMSC－vehicle組相比，cTnT的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，BMSC－isl1組與 BMSCs組及BMSC－vehicle組相比，cTnT的表達(dá)增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均 P ＜0.05)。

Figure 3.Effects of Isl1 on BMSC differentiation tested by examining the expression of cTnT.BMSCs，BMSC －vehicle and BMSC－isl1 stable cell line were co－cultured with neonatal rat ventricular myocytes for 1 week.The cells were harvested and cell lysates were subject to Western blotting assay..n=3.*P＜0.05 vs BMSCs or BMSC －vehicle.圖3 微環(huán)境中Isl1對BMSCs cTnT表達(dá)的影響

免疫熒光結(jié)果顯示(圖4)，BMSCs組和BMSC－vehicle組內(nèi)BMSCs有少量 α－actinin和cTnI的表達(dá)，而且2組表達(dá)量相近。BMSC－isl1組內(nèi)心肌特異性蛋白α－actinin和cTnI的表達(dá)量比BMSCs組及BMSC－vehicle組有顯著提高。

Figure 4.Immunostaining of α －actinin and cTnI in BMSCs，BMSC －vehicle and BMSC －isl1 stable cell line(×400).BMSCs，BMSC－vehicle and BMSC－isl1 stable cell line were seeded on coverslip and co－cultured with neonatal rat ventricular myocytes for 1 week，then the cells were fixed and stained.圖4 微環(huán)境中 Isl1對BMSCs α－actinin和cTnI表達(dá)的影響

討 論

盡管BMSCs的研究較多，但多為現(xiàn)象的觀察，其誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制知之甚少，甚至完全不了解，以致于目前所有的方法均誘導(dǎo)效率偏低，存活時間短，無法真正滿足臨床治療的需要。

無論是在胚胎期心臟發(fā)生，還是在干細(xì)胞向心肌分化過程中，Nkx2.5和 GATA4的表達(dá)是必需的［8］。GATA4是心臟前體細(xì)胞的最早期標(biāo)志之一，是心臟發(fā)育過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子［9］。Nkx2.5具有顯著的心臟特異性表達(dá)的特點(diǎn)，對心肌細(xì)胞的分化起到重要作用［10］。Nkx2.5的激活常常意味著心肌分化程序的啟動［11］。MEF2C被稱為心肌增強(qiáng)因子，含有2個LIM同源結(jié)構(gòu)域蛋白IslI結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步研究表明，在小鼠胚胎發(fā)育的心臟前期發(fā)生過程中，MEF2C是IslI的直接下游靶基因［12］。無獨(dú)有偶，微環(huán)境誘導(dǎo)下，BMSC－isl1向心肌樣細(xì)胞分化過程中，我們也觀察到MEF2C基因表達(dá)的升高。

微環(huán)境誘導(dǎo)下，BMSC－isl1組 GATA4、Nkx2.5和MEF2C等心臟轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)有明顯的增加，提示心肌分化程序已經(jīng)啟動，且表明BMSC－isl1向心肌方向分化的能力高于BMSCs和BMSC－vehicle組。

RyR2是主要在心肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)上表達(dá)的Ca2+釋放通道，大多數(shù)RyR2分布在肌質(zhì)網(wǎng)的膜區(qū)［13］。肌鈣蛋白是肌肉收縮的調(diào)節(jié)蛋白，具有高度的心肌特異性。心肌肌鈣蛋白(cardiac troponin，cTn)由3種不同基因的亞基組成:cTnT、cTnI和cTnC。在心肌細(xì)胞收縮和舒張過程中發(fā)揮重要作用［14］。α－actinin是區(qū)分肌細(xì)胞和非肌細(xì)胞彈力纖維的標(biāo)志。α－actinin的表達(dá)密度隨著心肌細(xì)胞的成熟同步增多［15］。

實(shí)驗(yàn)中共培養(yǎng)環(huán)境下，BMSCs、BMSC－vehicle和BMSC－isl13組細(xì)胞中檢測到心肌特異性蛋白RyR2、cTnT、cTnI以及 α －actinin的表達(dá)，結(jié)果和同類文獻(xiàn)報道相同［11］，說明3組細(xì)胞均向心肌樣細(xì)胞分化。其中，BMSCs組和BMSC－vehicle組各mRNSA和蛋白的表達(dá)量相當(dāng)，說明慢病毒對BMSCs的分化能力沒有影響。BMSC－isl1組較其它2組mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯提高，即BMSC－isl1的心肌分化能力要高于另外2組，提示Isl1對BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化起促進(jìn)作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，在乳鼠心肌原代細(xì)胞共培養(yǎng)的微環(huán)境中，Isl1具有提高BMSCs向心肌細(xì)胞分化的能力。這一結(jié)果為提高干細(xì)胞定向分化效率探索了新的途徑，亦使干細(xì)胞治療走向臨床又向前邁進(jìn)了一步。

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