吳 銳，胡文娟，李榮亨

(1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，江西 南昌 330006;2重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，重慶 400042)

免疫性疾病中常有一部分患者出現(xiàn)疼痛癥狀，往往隨著病情的緩解而緩解，對(duì)激素、靜脈用丙種球蛋白的反應(yīng)較鎮(zhèn)痛藥物更好［1］，因疼痛的發(fā)生與自身抗體及免疫復(fù)合物的形成有關(guān)，故稱之為“免疫相關(guān)性疼痛”。通常認(rèn)為這種疼痛是由于免疫復(fù)合物激活補(bǔ)體及免疫細(xì)胞、釋放促炎介質(zhì)導(dǎo)致，與其它炎癥性疼痛相似［2］。但臨床中此類患者的疼痛部位并無明顯炎癥反應(yīng)。最近有證據(jù)表明免疫復(fù)合物可直接激活神經(jīng)元細(xì)胞上的Fcγ受體I(Fc－gamma receptor I，F(xiàn)cγRI)而誘發(fā)疼痛及痛覺過敏，不需激活炎癥反應(yīng)致痛［3］。因此我們嘗試采用純化的IgG型特異性抗原抗體復(fù)合物建立免疫復(fù)合物致痛大鼠模型，并與甲醛致炎性痛大鼠模型比較，觀察大鼠疼痛行為、局部炎癥反應(yīng)及p38 MAPK在脊髓表達(dá)的改變，探討免疫復(fù)合物所致疼痛是否具有不同于普通炎性介質(zhì)致痛的疼痛特點(diǎn)及機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物及分組

30只清潔級(jí)健康成年雄性Sprague－Dawley大鼠來源于南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部(動(dòng)物許可證號(hào):江西醫(yī)動(dòng)證字第02196－02)，體重250 g左右。隨機(jī)分為對(duì)照組、免疫復(fù)合物組及甲醛組，每組10只。按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

2 主要儀器設(shè)備及試劑

正常小鼠IgG(Santa Cruz);純化大鼠抗小鼠抗體 (Jackson ImmunoResearch);Zeba脫鹽離心柱(Thermo Scientific)，抗p38 MAPK及抗磷酸化 p38 MAPK抗體(Cell Signaling);p38 MAPK抑制劑SB203580(Sigma);電泳槽、測試臺(tái)、von Frey機(jī)械痛刺激器等。

3 IgG免疫復(fù)合物制備［3］

抗原為正常小鼠IgG，抗體為純化的抗小鼠IgG的大鼠抗體。為防止疊氮化鈉的非特異性反應(yīng)，抗原及抗體均采用PBS緩沖液(0.01 mol/L)脫洗純化。抗原及抗體以10 mg/L濃度以1∶1比例在常溫下反應(yīng)1 h，并稀釋至1 mg/L。

4 實(shí)驗(yàn)過程

甲醛組、免疫復(fù)合物和對(duì)照組采用右后足底分別皮內(nèi)注射5%甲醛溶液、制備的IgG免疫復(fù)合物和PBS 緩沖液各20 μL。注射前及注射后1 h、2 h、4 h、8 h和12 h分別觀察大鼠后足皮膚局部變化、厚度、溫度及疼痛行為。在足底注射前，免疫復(fù)合物組及甲醛組隨機(jī)各取5只大鼠鞘內(nèi)注射SB203580(30 nmol∶10 μL)，而對(duì)照組取5只大鼠鞘內(nèi)給予2%二甲 基 亞 砜 (dimethylsulfoxide，DMSO)10 μL。SB203580溶解于2%DMSO中(PBS稀釋)。注射方法為乙醚麻醉下，穿刺針(直徑0.4 mm)經(jīng)由 L5－6椎間隙進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，當(dāng)穿刺針進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔時(shí)，大鼠會(huì)突然出現(xiàn)側(cè)向擺尾現(xiàn)象或有腦脊液流出［4］。穿刺成功后，緩慢注入溶液(約1 min)。造模后12 h取所有大鼠脊髓(L4－5)采用Western blotting方法測定p38 MAPK總蛋白及p－p38 MAPK的表達(dá)。

5 疼痛行為(自發(fā)痛、機(jī)械觸誘發(fā)痛反應(yīng))觀察

方法見參考文獻(xiàn)［5］。自發(fā)痛:動(dòng)物置于有機(jī)玻璃特制的透明觀測室內(nèi)，適應(yīng)20 min后，用攝像機(jī)記錄30 min，統(tǒng)計(jì)后肢自發(fā)抬腿次數(shù)和持續(xù)時(shí)間。機(jī)械觸誘發(fā)痛:動(dòng)物置于特制網(wǎng)格平臺(tái)上，不同強(qiáng)度的von Frey針絲，依次刺激右后足底皮膚，如大鼠產(chǎn)生明顯縮爪或舔足，即為陽性反應(yīng)。每只大鼠均從小強(qiáng)度的針絲開始刺激，每根針絲測量5次，至少能夠引發(fā)3次縮爪反應(yīng)的針絲強(qiáng)度即為機(jī)械痛閾值。每次測量時(shí)間1 s，尼龍絲彎曲弧度相同，以確保每次施加刺激相同。

6 p38 MAPK免疫印跡法(Western blotting)

在氯胺酮(2 mL/kg)麻醉下取L4－5脊髓。在置于干冰中的PBS混合液(含磷酸抑制劑及蛋白酶抑制劑)玻璃皿中進(jìn)行組織均漿。均漿液加入DNase裂解30 min。取勻漿液(每泳道20 μg)進(jìn)行SDSPAGE蛋白電泳，將蛋白質(zhì)從SDS－PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，0.1%TBS洗膜5min×3次;5%脫脂奶粉于室溫下封閉2 h，取膜，加入抗p38 MAPK抗體(1∶1000)、抗 p －p38 MAPK 抗體 (1∶1000)或β－actin(1∶2000)，4℃過夜。沖洗后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的II抗工作液(羊抗兔IgG，1∶500，用封閉液稀釋)37℃孵育1 h，0.1%TBS緩慢沖洗3次，充分顯色后用清水終止反應(yīng)。暗室中進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法顯影;高敏感膠片攝片。圖像分析軟件定量分析靶蛋白及內(nèi)參照β－actin條帶含量，求其比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 造模大鼠右后足局部皮膚反應(yīng)及自發(fā)痛的比較

甲醛致痛大鼠注射后右后足立即出現(xiàn)明顯紅腫及縮足、舔足等自發(fā)痛行為，并持續(xù)至注射后1 h以上，而免疫復(fù)合物組及對(duì)照組大鼠自右后足底皮下注射后注射部位一直無紅腫及自發(fā)痛表現(xiàn)。

2 造模大鼠右后足疼痛閾值的比較

2種致痛模型大鼠疼痛閾值均明顯下降(P＜0.01，P＜0.05)，但甲醛組疼痛閾值下降迅速，于30 min達(dá)到低谷后逐漸緩解，免疫復(fù)合物組疼痛閾值下降緩慢，于注射后8 h達(dá)到低谷。注射后12 h時(shí)，甲醛組與免疫復(fù)合物組疼痛閾值接近(P＞0.05)，但仍明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)，見圖1。

Figure 1.Pain threshold of rats without SB203580 treatment in the 3 groups after injection into the right hindpaw..n=5.*P ＜ 0.05，＊＊ P ＜ 0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs formalin.圖1 未使用p38 MAPK抑制劑的各組大鼠右后足注射后不同時(shí)間疼痛閾值的比較

3 造模大鼠脊髓p38 MAPK蛋白表達(dá)量的變化

與對(duì)照組比較，2種致痛模型組p38 MAPK總體蛋白表達(dá)水平均無明顯差異(P＞0.05)，但甲醛組大鼠激活態(tài)磷酸化的 p－p38表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01)。免疫復(fù)合物致痛組p－p38有少量表達(dá)，與對(duì)照組比無顯著差異(P＞0.05)，見圖2。

Figure 2.The expression of total p38 MAPK and p－p38 MAPK in the L4－5segment of spinal cord in rats without SB203580 treatment in the 3 groups after injection into the right hindpaw.Lane 1:control;Lane 2:immune complex;Lane 3:formalin..n=10.＊＊P＜0.01 vs control or immune complex group.圖2 右側(cè)足底注射后3組大鼠模型脊髓p38－MAPK及p－p38 MAPK蛋白表達(dá)的比較

4 治療大鼠局部皮膚反應(yīng)及疼痛行為的比較

鞘內(nèi)預(yù)先注射SB203580后，甲醛組大鼠自發(fā)痛行為及疼痛閾值降低均明顯輕于未經(jīng)治療的同組大鼠(P＜0.05)，見圖3A、B;而免疫復(fù)合物組及對(duì)照組中，使用SB203580并未對(duì)大鼠后足疼痛閾值造成明顯影響(P ＞0.05)，見圖3C、D。

Figure 3.Comparison of rat pain behavior between rats with SB203580 or without SB203580 in the same group after injection into the right hindpaw..n=5.*P＜0.05 vs formalin without SB203580.圖3 使用p38MAPK抑制劑SB203580與未使用SB203580在足底注射后的大鼠疼痛行為的變化

討 論

2004年Andoh首次提出IgG型免疫復(fù)合物可直接引起痛覺初級(jí)感覺神經(jīng)元細(xì)胞興奮［6］。此后又有人證實(shí)FcγRI可以表達(dá)于與疼痛相關(guān)的神經(jīng)元上，而免疫復(fù)合物可直接激活神經(jīng)元的FcγRI，導(dǎo)致鈣內(nèi)流增加，RMP去極化，動(dòng)作電位釋放產(chǎn)生慢性痛［3］。

本實(shí)驗(yàn)顯示當(dāng)一定濃度純化的IgG型抗原抗體復(fù)合物注入大鼠后足后可以導(dǎo)致大鼠后足疼痛閾值出現(xiàn)明顯下降，并持續(xù)12 h以上，而大鼠注射部位始終無紅腫表現(xiàn)。這說明適宜濃度的IgG型特異性抗原復(fù)合物有效地誘導(dǎo)了大鼠疼痛，但在疼痛部位并未產(chǎn)生傷害性刺激并引起明顯炎癥反應(yīng)。因此本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果更支持非炎癥致痛理論，即疼痛更可能是因抗原抗體復(fù)合物直接興奮神經(jīng)元細(xì)胞 Fcγ而產(chǎn)生。

普通炎癥介質(zhì)可以造成傷害性刺激并引起局部炎癥反應(yīng)促使釋放大量致痛性炎癥因子，這些炎癥因子傳遞痛覺信息并導(dǎo)致疼痛異常［7］，而脊髓p38 MAPK信號(hào)通路的激活在促進(jìn)炎癥因子釋放及病理痛的維持中有著重要作用［8－10］。甲醛致痛模型是常用的炎癥性疼痛模型［11］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示甲醛所致炎癥性疼痛大鼠注射部位立即出現(xiàn)明顯紅腫熱痛的炎癥反應(yīng)，而脊髓p38 MAPK被顯著激活，使用p38 MAPK抑制劑后，大鼠后足局部紅腫癥狀明顯減輕，且疼痛異常亦顯著緩解，證實(shí)炎癥反應(yīng)以及脊髓p38MAPK信號(hào)通路在炎癥性疼痛中起著關(guān)鍵性作用。

脊髓p38 MAPK通路在免疫復(fù)合物所致病理痛中并未明顯活化，且使用p38 MAPK抑制劑對(duì)其疼痛并無影響，因此可以推論免疫復(fù)合物的大鼠疼痛與注射物造成的炎癥反應(yīng)及脊髓p38 MAPK通道無顯著相關(guān)性。免疫復(fù)合物致痛無論在疼痛表現(xiàn)還是發(fā)病機(jī)制上都與甲醛致炎病癥有著顯著區(qū)別。

近年來關(guān)于免疫復(fù)合物致痛的研究極為少見，其致痛機(jī)制因被簡單歸為炎癥性疼痛，未得到足夠重視。而事實(shí)上這種疼痛在許多免疫性疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、格林巴利等)中均有報(bào)道，且病程更長，治療更為棘手［1，12］。本實(shí)驗(yàn)首次嘗試建立特異性抗原免疫復(fù)合物致痛大鼠模型，并證實(shí)了此模型具有不同于普通炎癥介質(zhì)致痛特點(diǎn)。

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