王淑君，劉立賓，黎關(guān)龍，王園園，周俊輝，趙 珊，劉亞坤，王萬鐵△

(溫州醫(yī)學(xué)院1病理生理學(xué)教研室，2檢驗醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035;3浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院結(jié)核化驗室，浙江 杭州 310003)

國內(nèi)外研究證實缺氧性肺動脈收縮反應(yīng)(hypoxic induced pulmonary vasoconstriction，HPV)是慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)的始動因素，但COPD等的肺循環(huán)缺氧狀態(tài)常同時伴有二氧化碳潴留，因此研究低氧高二氧化碳性肺動脈收縮(hypoxic hypercapnia－induced pulmonary vasoconstriction，HHPV)的發(fā)生機制更具理論和實踐意義。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPKs)是細胞內(nèi)的一類絲氨酸 /蘇氨酸蛋白激酶，主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK 1/2)和p38 MAPK。以往研究表明肺動脈高壓的發(fā)生可能與該通路的激活有關(guān)［1－2］。

三七總皂苷(panax notoginseng saponin，PNS)為三七的主要有效成分，具有降壓［3］、鈣拮抗［4－5］等作用，三七皂苷單體 R1(notoginsenoside monomer R1，R1)為其主要單體成分對肺血管的作用未見報道。我們課題組前期研究［6－7］表明 PNS可通過抑制MAPK通路減輕大鼠低氧高二氧化碳性肺動脈高壓的形成。R1在低氧高二氧化碳性肺血管收縮和肺動脈高壓的形成過程中是否起作用?其作用機制如何?為此，我們選擇了MAPKs通路中的p38 MAPK通路，采用不同濃度R1對低氧高二氧化碳條件下肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)進行干預(yù)，觀察p38 MAPK蛋白的磷酸化水平及p38 MAPK mRNA水平，探討R1的可能作用機制，以期為R1臨床治療缺氧和高碳酸血癥引起的肺血管收縮及肺動脈高壓提供必要的實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

材料和方法

1 動物和藥品

SPF級標準健康雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠10只，體重200～220 g，由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物許可證號為SCXK(浙)2008－0156號。R1由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院有機化學(xué)教研室提供，純度＞98%，溶于DMSO，10 g/L，存于4℃;DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco;臺盼藍購自Sigma;RT－PCR試劑盒、平滑肌 α－actin單克隆抗體、SABC－FITC(POD)雙標試劑盒和濃縮型二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)試劑盒購自 TaKaRa;兔抗鼠磷酸化p38 MAPK(p－p38 MAPK)、兔抗鼠p38 MAPK和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的羊抗兔Ⅱ抗購自Cell Signal Technology;BCA蛋白定量試劑盒和增強化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Pierce;其余試劑為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 PASMCs原代培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死大鼠，75%乙醇中浸泡，超凈平臺內(nèi)解剖顯微鏡直視下取2～4級肺動脈，無菌棉簽去內(nèi)皮細胞，37℃下0.2%膠原酶Ⅰ消化約2～4 h，離心棄上清，用20%胎牛血清DMEM漂洗沉淀，在漂洗的培養(yǎng)皿中會脫落大量單個平滑細胞，將此培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，第2 d細胞貼壁，7 d傳代。

2.2 PASMCs的鑒定

2.2.1 細胞形態(tài)鑒定 倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并攝片。

2.2.2 免疫細胞化學(xué)鑒定 參照SABC－POD免疫組化試劑盒說明操作。光鏡觀察細胞核染成棕黃色為陽性，每張玻片在顯微鏡下放大200倍隨機選取3個視野計數(shù)，用陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的百分比即陽性率表示細胞純度，達95%以上方可用于實驗。

2.3 藥物干預(yù)及實驗分組 取第2～5代生長良好的對數(shù)生長期PASMCs，制成細胞懸液，按5×108/L細胞密度接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待融合成單層細胞時(約80%鋪滿)換成無血清培養(yǎng)基饑餓24 h，然后行藥物干預(yù)(30 min內(nèi)完成加藥操作)。分組:(1)常氧(normoxia，N)組:不予任何干預(yù)因素;(2)低氧高二氧化碳(hypoxic hypercapnia，H)組:低氧高二氧化碳干預(yù);(3)DMSO對照組(HD):低氧高二氧化碳+0.05%DMSO干預(yù);(4)R1干預(yù)組(R8、R40、R100):低氧高二氧化碳 +8、40、100 mg/L R1。予 N組5%CO2、21%O2氣體條件，37℃孵育24 h;予H、HD組及R1干預(yù)組6%CO2、1%O2氣體條件，37℃孵育24 h。

2.4 蛋白免疫印跡法檢測PASMCs p－p38 MAPK蛋白含量 棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS清洗3次，每孔加入細胞裂解液100 μL，冰面上裂解30 min，12000 r/min、4℃ 離心5 min，取上清液，BCA法蛋白定量。以10%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕式電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下用封閉液封閉2 h后加入Ⅰ抗兔抗鼠p38 MAPK和p－p38 MAPK多克隆抗體(1∶1000稀釋)，4℃ 反鋪法孵育過夜，抗兔IgGⅡ抗(1∶4000稀釋)反應(yīng)2 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，X射線底片曝光。實驗重復(fù)8次，p38 MAPK蛋白作為內(nèi)參照。

2.5 半定量RT－PCR檢測p38 MAPK mRNA的表達 棄培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS清洗3次，每孔加700 μL Trizol，反復(fù)吹打，至液體澄清，轉(zhuǎn)至EP管靜置，加氯仿，劇烈顛倒混勻，靜置，4℃、12000 r/min離心，轉(zhuǎn)含RNA上層水相于另一EP管，加冰冷異丙醇，適度顛倒混勻，靜置，4℃、12000 r/min離心，棄上清，加預(yù)冷75%乙醇，4℃、7500 r/min離心，棄上清，空氣干燥，溶于DEPC水，于核酸濃度檢測儀測定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴增反應(yīng):p38上游序列5'－TCCAAGGGCTACACCAAATC －3'，下游序列5'－TGTTCCAGGTAAGGGTGAGC－3'，反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃ 2 min，98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，最后72℃ 10 min，擴增片段為341 bp;β－actin上游序列5'－GAGACCTTCAACACCCCAGCC －3'，下游序列5'－ TCGGGGGATCGGAACCGCTCA －3'，反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃ 2 min，98℃ 10 s，53℃ 15 s，72℃30 s，最后再72℃ 10 min，擴增片段為400 bp。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 原代培養(yǎng)大鼠PASMCs的分離和培養(yǎng)及鑒定

1.1 形態(tài)學(xué)觀察細胞生長特點 原代培養(yǎng)5～7 d呈典型的“峰－谷”狀生長，鏡下顯示細胞呈梭形，連續(xù)培養(yǎng)多代仍可保持較好狀態(tài)，見圖1A、B。

1.2 免疫細胞化學(xué)染色法鑒定PASMCs 經(jīng)平滑肌α－actin免疫細胞化學(xué)染色后，胞漿著色，約98%呈陽性反應(yīng)，即高倍鏡下可見胞漿內(nèi)大量棕黃色、與細胞長軸平行的纖維細絲，此為平滑肌α－actin，核卵圓形居中，呈淡藍色，見圖1C。

Figure 1.Identification of rat PASMCs.A:primarily cultured rat PASMCs(×200);B:primarily cultured rat PASMCs(×400);C:expression of smooth muscle α－actin in rat PASMCs(immunocytochemical staining，×400).圖1 原代培養(yǎng)大鼠PASMCs的鑒定

2 各組細胞p－p38 MAPK相對表達量比較

N組p－p38 MAPK蛋白弱表達。與HD組相比，R1各濃度組p38MAPK表達水平均顯著下調(diào)(P＜0.05)。各濃度組之間p－p38 MAPK表達呈濃度依賴性，R100組 ＜R40組 ＜R8組，R100組和 R8組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，二者與R40組之間均無顯著差異(P＞0.05)，見圖2。

3 各組細胞p38 MAPK mRNA相對表達量比較

N組p38 MAPK mRNA表達較HD組和R1各濃度組均明顯減弱(P＜0.05)。各濃度組之間p38 MAPK mRNA表達呈濃度依賴性，R100組＜R40組＜R8組，R100組和R8組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

Figure 2.Expression of p－p38 MAPK protein in rat PASMCs from different groups..n=8.＊＊P＜0.01 vs N;△△P ＜0.01 vs H;▲▲P ＜0.01 vs HD;##P ＜0.01 vs R8.圖2 各組大鼠PASMCs p－p38 MAPK蛋白的表達

Figure 3.Expression of p38 MAPK mRNA in rat PASMCs from different groups.M:marker..n=8.＊＊P＜0.01 vs N;△△P＜0.01 vs H;▲▲P ＜0.01 vs HD;#P ＜0.05 vs R8.圖3 各組大鼠PASMCs p38 MAPK mRNA的表達

4 PASMCs p－p38 MAPK蛋白表達與p38 MAPK mRNA表達的相關(guān)性分析

R1各干預(yù)組p－p38 MAPK蛋白與p38 MAPK mRNA呈正相關(guān)(r=0.958，P＜0.01)，見圖4。

討 論

Figure 4.The correlation analysis between p－p38 MAPK protein and p38 MAPK mRNA in all groups(r=0.958，P ＜0.01).圖4 各組大鼠PSAMCs p－p38 MAPK蛋白與p38 MAPK mRNA的相關(guān)分析

目前認為低氧高二氧化碳引起HHPV的機制主要有兩大假說［8］:其一介質(zhì)學(xué)說，即低氧為低氧通過釋放血管收縮劑和血管擴張劑而激發(fā)HPV，主要包括一氧化氮(NO)、鈣基因相關(guān)肽(CGRP)的舒血管效應(yīng)，內(nèi)皮素(ET)的縮血管效應(yīng)和緩激肽(BK)、組胺的舒縮雙重作用;其二為直接學(xué)說，即低氧直接作用于PASMCs使其發(fā)生收縮而引起HPV，即低氧情況下，鉀通道、鈣通道、氯通道通過一系列復(fù)雜的分子和電生理機制，最終導(dǎo)致細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，觸發(fā)興奮－收縮偶聯(lián)機制，使PASMCs收縮［9］?，F(xiàn)在普遍認為，在HPV的形成發(fā)展中，后一學(xué)說占主導(dǎo)地位，前者僅參與調(diào)節(jié)HPV的程度。低氧是引起PASMCs增殖的重要因素，是其凋亡減少的重要原因之一，肺動脈平滑肌細胞增殖與凋亡的失衡參與了肺動脈高壓的發(fā)生過程，其主要機制為直接增加PASMCs代謝或通過增加細胞內(nèi)鈣離子濃度等途徑實現(xiàn)［10］。

我們之前的研究表明三七總皂苷是一種鈣拮抗劑，且能夠通過抑制p38 MAPK通路活性減輕肺動脈高壓的程度。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，其主要成分單體R1具有相似或相近的作用。本實驗中，我們分析實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):低氧高二氧化碳條件下分別予低、中、高濃度 R1孵育后，肺動脈平滑肌細胞 p－p38 MAPK蛋白表達均明顯低于低氧高二氧化碳和DMSO對照組，而且mRNA表達變化與蛋白基本一致，二者呈顯著正相關(guān)。這提示R1為三七總皂苷減輕肺動脈高壓的有效作用成分，可能通過降低 p38 MAPK通路的活化，從而抑制低氧性肺平滑肌細胞收縮，進而起到緩解肺動脈高壓的形成以及肺血管重建的作用。陳重華等［11］報道R1能顯著改善正常小鼠耳廓微循環(huán)并延長凝血時間，其機制是使細動脈和細靜脈的血管口徑顯著增大，能使耳廓毛細血管開放數(shù)量明顯增多。

此外，我們的結(jié)果還顯示:作用于p38 MAPK通路的R1最佳濃度為100 mg/L。有研究報道較低濃度(0.5～3 g/L)PNS促進血管平滑肌細胞增殖，較高濃度(6 g/L)則抑制增殖誘發(fā)凋亡，可能與激活JNK1/2磷酸化通路有關(guān)［12］。這種雙向作用提示不同濃度藥物可能激活或抑制不同的MAPK通路，影響細胞增殖與凋亡。

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