黃 毅，胡建達(dá)，鄭 靜，李 靜，魏天南，鄭志紅，陳英玉

(福建醫(yī)科大學(xué)1附屬協(xié)和醫(yī)院，福建省血液病研究所，2省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350001)

黃芩苷在體外可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖［1－4］，體內(nèi)研究同樣顯示黃芩苷具有明顯的抗腫瘤活性。Ikemoto等［5］對(duì)C3H/HeN鼠行皮下移植鼠膀胱腫瘤－2(mouse bladder tumor－2，MBT－2)細(xì)胞致瘤，每天以10 mg的黃芩提取物灌胃處理1次，共10 d，于第20 d和第25 d測(cè)得的瘤體積明顯小于對(duì)照組;而體外實(shí)驗(yàn)表明黃芩苷是黃芩提取物中發(fā)揮抗MBT－2膀胱癌細(xì)胞增殖的最主要活性成分。此外，黃芩苷對(duì)A549肺癌、艾氏腹水瘤、黑色素瘤的小鼠腫瘤模型也具有明顯的抑制作用［6－8］。我們前期體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃芩苷能明顯抑制人Burkitt淋巴瘤CA46細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡［9］，在此基礎(chǔ)上，本研究擬建立CA46細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型，進(jìn)一步探討黃芩苷體內(nèi)抗Burkitt淋巴瘤的作用及其可能機(jī)制，目前國(guó)內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。

材料和方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)體系和藥物

高致瘤CA46細(xì)胞引自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液病研究所，由福建省血液病研究所傳代保存，用含10%胎牛血清(Gibco)的RPMI－1640培養(yǎng)液(Gibco)，置37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液傳代1次;實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。黃芩苷購(gòu)自南京青澤醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司，5%NaHCO3溶解備用;依托泊甙(etoposide，VP－16)為上海華聯(lián)制藥有限公司產(chǎn)品，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)為江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，均以雙蒸水溶解備用。

2 動(dòng)物

6～8周齡的BABL/c裸鼠，體重16～18 g，雌雄各半，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心，為無(wú)特殊致病菌(specific pathogen－free，SPF)動(dòng)物，合格證號(hào)為SCXK(滬)2007－0005。所有裸鼠在福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)為SYXK閩2008－0001)SPF層流柜中飼養(yǎng)。

3 CA46細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

飼養(yǎng)第3 d開始對(duì)每只裸鼠行腹腔注射10 g/L環(huán)磷酰胺0.2 mL，1次/d，連續(xù)2 d;第5 d收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的高致瘤CA46細(xì)胞，在每只裸鼠右后背側(cè)皮下接種0.2 mL細(xì)胞懸液(8×106個(gè)細(xì)胞/只)，7 d后觀察成瘤率達(dá)100%，選擇腫瘤直徑0.5～0.6 cm的裸鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為5%NaHCO3陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(4 mg/kg VP－16)以及黃芩苷高(60 mg/kg)、中(30 mg/kg)、低(15 mg/kg)3個(gè)濃度用藥組，每組12只裸鼠，雌雄各半，均采用腹腔注射方式給藥，每次0.2 mL，每天1次，連續(xù)12 d。

4 給藥12 d后檢測(cè)的指標(biāo)

4.1 體重、血常規(guī)及肝、腎功能的檢測(cè) 末次給藥后24 h，每組均隨機(jī)取出6只裸鼠，雌雄各半，留下的6只裸鼠用以觀察荷瘤生存時(shí)間。對(duì)取出的裸鼠行體重稱量后，每只腹腔注射0.5%肝素0.5 mL，使之肝素化，5～6 min后摘除眼球取血，一部分肝素抗凝全血用以檢測(cè)血常規(guī)中白細(xì)胞 (leukocyte，Leu)、血紅蛋白 (haemoglobin，Hb)和血小板 (platalet，Plt)的濃度;另一部分離心分離出血漿用以檢測(cè)肝功能中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、γ－谷氨酰轉(zhuǎn)移酶 (γ－glutamyltransferase，γ－GT)和腎功能中血尿素氮 (blood urea nitrogen，BUN)、肌酐 (creatinine，Cr)的濃度。

4.2 抑瘤率的檢測(cè) 取血后，頸椎脫臼處死裸鼠，立即完整剝離瘤塊，稱量離體瘤塊重量，計(jì)算各組平均瘤塊重量及抑瘤率。抑瘤率(%)=［1－(給藥組平均瘤重/陰性對(duì)照組平均瘤重)］×100%。

4.3 透射電鏡觀察瘤組織細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) 切取各組裸鼠的部分新鮮瘤塊，1 mm×1 mm×1 mm大小數(shù)塊，迅速放入4℃預(yù)冷的2.5%戊二醛和1%多聚甲醛混合固定液中固定，1%鋨酸固定后，環(huán)氧樹脂618包埋，超薄切片，用醋酸鈉和枸櫞酸銅染色，日立HU－12A型透射電鏡下觀察瘤組織細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

4.4 病理組織學(xué)檢查 分別切取各組裸鼠的部分新鮮瘤塊置10%甲醛中固定后，常規(guī)制作石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察。

4.5 Western blotting檢測(cè)瘤塊組織蛋白激酶B(protein kinase，Akt)、磷酸化 Akt(phospho－Akt，p－Akt)、核因子 －κB(nuclear factor－kappa B，NF－κB)p65、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn) (mammalian target of rapamycin，mTOR)、磷酸化 mTOR(phosphomTOR，p－mTOR)蛋白的表達(dá) 將切取的各組裸鼠新鮮瘤塊組織充分研磨，過(guò)濾后提取蛋白，以β－actin蛋白為內(nèi)參照，采用Western blotting檢測(cè)各組相應(yīng)蛋白表達(dá)的變化;所用β－actin鼠抗購(gòu)自NeoMarkers，Akt、p － Akt(Ser32)、mTOR 和 p － mTOR(Ser2448)兔抗購(gòu)自 Cell Signaling Technology，NF－κB p65兔抗購(gòu)自 eBioscience，操作步驟詳見文獻(xiàn)［9］。

5 荷瘤裸鼠生存時(shí)間觀察

從首次給藥時(shí)間算起繼續(xù)對(duì)各組留下觀察生存時(shí)間的荷瘤裸鼠行腹腔注射藥物，每次0.2 mL，2 d 1次，直至裸鼠全部死亡，期間對(duì)每只裸鼠的生存時(shí)間均予以記錄，計(jì)算各組荷瘤裸鼠不同階段的生存率和生存延長(zhǎng)率。生存延長(zhǎng)率(%)=(給藥組平均生存時(shí)間－陰性對(duì)照組平均生存時(shí)間)/陰性對(duì)照組平均生存時(shí)間×100%。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 黃芩苷對(duì)荷瘤裸鼠血常規(guī)、肝腎功能和體重的影響

腹腔注射12 d后，陽(yáng)性對(duì)照組(4 mg/kg VP－16)荷瘤裸鼠的白細(xì)胞數(shù)為(8.4±2.1)×109/L，明顯低于陰性對(duì)照組的(11.6±2.0)×109/L(P＜0.05);而30 mg/kg和60 mg/kg黃芩苷給藥組血常規(guī)、肝腎功能和體重的檢測(cè)結(jié)果與陰性對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見表1。

2 黃芩苷對(duì)CA46細(xì)胞裸鼠異種移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用

腹腔注射黃芩苷12 d后處死各組部分裸鼠取瘤塊稱重的結(jié)果顯示，30 mg/kg黃芩苷組、60 mg/kg黃芩苷組瘤塊重量均明顯低于陰性對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01)，抑瘤率分別為28.4%和51.9%，呈現(xiàn)劑量依賴性，提示黃芩苷對(duì)CA46細(xì)胞裸鼠異種移植瘤的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，見圖1、表2。

表1 給藥12 d后裸鼠的血常規(guī)、肝腎功能和體重檢測(cè)結(jié)果Table 1.The results of blood，liver and renal function assay，and body weight in nude mice with CA46 cell xenografts after drug injection for 12 d(.n=6)

表1 給藥12 d后裸鼠的血常規(guī)、肝腎功能和體重檢測(cè)結(jié)果Table 1.The results of blood，liver and renal function assay，and body weight in nude mice with CA46 cell xenografts after drug injection for 12 d(.n=6)

*P ＜0.05 vs negative control group.

Index Negative control 30 mg/kg baicalin 60 mg/kg baicalin Positive control(4 mg/kg VP－16)Leukocyte(×109/L) 11.6 ±2.0 11.9 ±1.7 11.4 ±1.8 8.4 ±2.1*Hb(g/L) 117.3 ±10.6 116.5 ±11.3 120.7 ±12.6 106.5 ±9.2 Platelet(×109/L) 1098.3 ±194.6 1103.1 ±167.3 1078.8 ±157.3 1002.5 ±159.3 ALT(U/L) 64.5 ±8.3 61.3 ±11.8 66.7 ±11.6 63.8 ±8.8 γ － GT(U/L) 51.8 ±8.6 57.5 ±10.1 52.8 ±7.5 55.5 ±6.5 BUN(mmol/L) 7.1 ±0.7 7.2 ±0.8 6.9 ±1.2 7.0 ±1.0 Cr(μmol/L) 61.5 ±10.2 65.2 ±12.2 59.5 ±10.7 62.2 ±13.0 Body weight(g)22.6 ±2.4 22.3 ±2.5 21.9 ±2.8 21.2 ±3.1

Figure 1.The CA46 cell xenografts in all groups after drug injection for 12 d.圖1 給藥12 d后各組裸鼠的瘤塊大小

表2 給藥12 d后各組瘤塊重量及抑瘤率比較Table 2.The weight and inhibitory rate of CA46 cell xenografts in all groups after drug injection for 12 d(.n=6)

表2 給藥12 d后各組瘤塊重量及抑瘤率比較Table 2.The weight and inhibitory rate of CA46 cell xenografts in all groups after drug injection for 12 d(.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs negative control group.

Group Weight(g) Inhibitory rate(%)53.6 Negative control 1.83 ±0.19 －15 mg/kg baicalin 1.74 ±0.17 4.930 mg/kg baicalin 1.31 ±0.37* 28.460 mg/kg baicalin 0.88 ±0.42＊＊ 51.9 Positive control(4 mg/kg VP －16) 0.85 ±0.44＊＊

3 透射電鏡觀察瘤塊組織細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

30 mg/kg黃芩苷組、60 mg/kg黃芩苷組和陽(yáng)性對(duì)照組(4 mg/kg VP－16)的瘤塊組織經(jīng)透射電鏡觀察，瘤細(xì)胞凋亡現(xiàn)象多見，形態(tài)特點(diǎn)如下:核染色質(zhì)固縮，聚集于核膜下，呈界限分明的顆粒狀或半月形小體，胞漿固縮;相比之下，陰性對(duì)照組瘤細(xì)胞排列密集，形態(tài)正常，細(xì)胞核染色質(zhì)呈均質(zhì)狀，見圖2。

4 瘤塊病理組織學(xué)改變

光鏡下觀察，可見30 mg/kg黃芩苷組、60 mg/kg黃芩苷組和陽(yáng)性對(duì)照組(4 mg/kg VP－16)瘤塊組織中的瘤細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞體積變小，核深染，有的細(xì)胞固縮，有的僅存胞核，可見不規(guī)則壞死、出血;相比之下，陰性對(duì)照組瘤細(xì)胞排列密集，瘤細(xì)胞形態(tài)正常，呈圓形或橢圓形、大小均一，見圖3。

Figure 2.The cell ultrastructure of CA46 cell xenografts in nude mice after drug injection for 12 d(×6300).A:negative control group;B:30 mg/kg baicalin group;C:60 mg/kg baicalin group;D:positive control(4 mg/kg VP－16)group.→:apoptosis.圖2 給藥12 d后瘤塊細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

Figure 3.The pathological changes of CA46 cell xenografts in nude mice after drug injection for 12 d(×200).A:negative control group;B:30 mg/kg baicalin group;C:60 mg/kg baicalin group;D:positive control(4 mg/kg VP－16)group.→:necrosis and hemorrhage.圖3 給藥12 d后瘤塊病理變化

5 Western blotting 檢測(cè)瘤塊組織 Akt、p －Akt、NF－κB、mTOR和p－mTOR蛋白的表達(dá)

給藥12 d后，30 mg/kg黃芩苷組和60 mg/kg黃芩苷組瘤塊組織 p－Akt、NF－κB、mTOR和 pmTOR蛋白的表達(dá)水平均明顯低于陰性對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01)，呈劑量依賴性;而 Akt的表達(dá)無(wú)明顯改變，見圖 4、5。

6 荷瘤裸鼠生存時(shí)間觀察

陰性對(duì)照組荷瘤裸鼠的生存時(shí)間僅(49.7±14.6)d，至71 d即全部死亡;而黃芩苷用藥組隨著藥物劑量的增加，裸鼠的生存時(shí)間得到延長(zhǎng):30 mg/kg組的生存時(shí)間(62.2±17.0)d，生存延長(zhǎng)率25.2%;60 mg/kg組的生存時(shí)間(70.8±19.1)d，生存延長(zhǎng)率42.4%，與陰性對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.05)，見圖6。

討 論

Figure 4.The expression of Akt，p － Akt，NF － κB，mTOR and p－mTOR proteins，in CA46 cell xenografts in nude mice after drug injection for 12 d.Lane 1:negative control group;Lane 2:30 mg/kg baicalin group;Lane 3:60 mg/kg baicalin group;Lane 4:positive control(4 mg/kg VP －16)group.圖4 給藥12 d后瘤塊組織 Akt、p－Akt、NF－κB、mTOR和p－mTOR蛋白表達(dá)的變化

Figure 5.The comparison of Akt，p －Akt，NF － κB，mTOR and p－mTOR protein expression of CA46 cell xenografts in nude mice after drug injection for 12 d.β－actin protein was used as an internal control..n=6.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs negative control group.圖5 給藥12 d后瘤塊組織 Akt、p－Akt、NF－κB、mTOR和p－mTOR蛋白相對(duì)灰度值的比較

Figure 6.The Kaplan－Meier survival curves of nude mice with CA46 cell xenografts in all groups.n=6.圖6 各組荷瘤裸鼠Kaplan－Meier生存曲線

自1969年Rygarrd首次在裸鼠身上成功移植人類腫瘤后，裸鼠異種移植瘤模型就成為人們進(jìn)行腫瘤實(shí)驗(yàn)性治療廣泛采用的研究手段，人體內(nèi)腫瘤與人腫瘤細(xì)胞裸鼠異種移植瘤對(duì)藥物反應(yīng)的一致性已獲得證實(shí)［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)建立的CA46細(xì)胞裸鼠異種移植瘤行腹腔注射方式給藥12 d后，30 mg/kg黃芩苷組和60 mg/kg黃芩苷組的抑瘤率達(dá)到28.4%和51.9%，提示黃芩苷具有明顯的體內(nèi)抗Burkitt淋巴瘤活性，且作用呈現(xiàn)劑量依賴性，在一定范圍內(nèi)濃度越高，抑瘤作用越明顯。生存時(shí)間是評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物療效的最可靠指標(biāo)之一，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芩苷作用還可延長(zhǎng)荷瘤裸鼠的生存時(shí)間，30 mg/kg黃芩苷和60 mg/kg黃芩苷將裸鼠的生存時(shí)間分別延長(zhǎng)了25.2%和42.4%，且60 mg/kg黃芩苷組的生存時(shí)間與陰性對(duì)照組相比較差異顯著(P＜0.05)。腫瘤的形成和發(fā)展是十分復(fù)雜的過(guò)程，涉及多種細(xì)胞因子和信號(hào)通路的改變，單純依靠黃芩苷在治療的后期難以控制腫瘤的生長(zhǎng)，將黃芩苷與其它化療藥物聯(lián)用，能否減少腫瘤的耐藥性，進(jìn)一步提高荷瘤裸鼠的生存時(shí)間有待探討。

細(xì)胞死亡方式有2種:一是凋亡，它是散在于腫瘤組織中的單個(gè)細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)的死亡，死亡細(xì)胞的染色質(zhì)凝集，嗜堿性染色增強(qiáng)，然后細(xì)胞核崩解，但細(xì)胞的質(zhì)膜不破裂、不引發(fā)急性炎癥反應(yīng);二是壞死，它是腫瘤內(nèi)范圍不等的局部細(xì)胞死亡，死亡細(xì)胞的質(zhì)膜崩解、組織自溶，并引發(fā)急性炎癥反應(yīng)［11］。本研究采用透射電鏡法和病理組織學(xué)法觀察黃芩苷作用后裸鼠瘤塊組織的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30 mg/kg組和60 mg/kg組腫瘤細(xì)胞凋亡和壞死現(xiàn)象多見，而陰性對(duì)照組偶見凋亡和壞死細(xì)胞，提示黃芩苷一方面可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，另一方面又可引起腫瘤細(xì)胞壞死，通過(guò)上述2種方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡而發(fā)揮體內(nèi)抗Burkitt淋巴瘤的作用。

PI3K/Akt是體內(nèi)重要的信號(hào)通路之一，在介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、存活和凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。近來(lái)的研究表明，該通路的持續(xù)活化可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡通路受阻，或細(xì)胞周期進(jìn)程加快，使正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化，與血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療密切相關(guān)［12］。Akt是PI3K/Akt信號(hào)通路的主要調(diào)節(jié)分子，通過(guò)磷酸化而激活，而轉(zhuǎn)錄因子NF－κB和控制翻譯蛋白mTOR是其下游的兩個(gè)重要靶分子，也是抗血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療上的重要作用靶點(diǎn)［12－13］。本研究結(jié)果顯示黃芩苷明顯抑制了瘤塊組織Akt的磷酸化，并導(dǎo)致NF－κB和mTOR表達(dá)水平的下降及mTOR磷酸化的受阻，提示黃芩苷體內(nèi)抗Burkitt淋巴瘤作用的機(jī)制可能與下調(diào)PI3K/Akt/NF－κB和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。

藥物濃度超過(guò)一定范圍會(huì)帶來(lái)毒副作用，通常表現(xiàn)在對(duì)胃腸道、造血系統(tǒng)及肝腎功能的影響上。本研究在給藥12 d期間觀察成瘤裸鼠一般狀況，高、中、低3種濃度黃芩苷給藥組均未見裸鼠有消瘦、厭食、活躍程度下降等明顯異常;給藥12 d后的血常規(guī)和肝腎功能檢測(cè)結(jié)果顯示，30 mg/kg和60 mg/kg黃芩苷給藥組和陰性對(duì)照組比較均無(wú)顯著差異(P＞0.05)，提示在本給藥劑量下，黃芩苷對(duì)CA46細(xì)胞具有選擇性殺傷作用，而對(duì)裸鼠正常血細(xì)胞和肝、腎器官無(wú)明顯毒副作用。相比之下，陽(yáng)性對(duì)照組荷瘤裸鼠的白細(xì)胞數(shù)明顯低于陰性對(duì)照組(P＜0.05)，推測(cè)與VP－16具一定的骨髓抑制性有關(guān)。

細(xì)胞增殖和凋亡是一個(gè)由多因素、多分子參與的復(fù)雜過(guò)程。黃芩苷在體內(nèi)抑制CA46細(xì)胞裸鼠異種移植瘤生長(zhǎng)并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的過(guò)程，是否有其它信號(hào)通路，以及Akt下游其它靶分子的參與，有待進(jìn)一步研究。

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