倪 娟，陳亞俠，盧紅鮮，程 蓓，萬小云，謝 幸

(1杭州師范大學附屬醫(yī)院婦科腫瘤科，浙江 杭州 310015;2浙江大學醫(yī)學院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科腫瘤科，浙江 杭州 310006)

卵巢上皮癌是婦科癌癥最主要的死亡原因，晚期患者的5年生存率僅為30%［1］。近年來研究表明，卵巢上皮癌的發(fā)生與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導密切相關(guān)［2］。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)是90年代以來發(fā)現(xiàn)的最重要的生長信號調(diào)節(jié)蛋白，其成員細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal－regulated kinases，ERKs)與細胞的增殖、分化有關(guān)［3］。本研究通過Western印跡方法測定正常卵巢組織、良性卵巢組織以及卵巢上皮癌組織中的ERK活性形式即磷酸化ERK(phosphorylated ERK，p－ERK)含量，并收集卵巢上皮癌患者的臨床資料，包括患者的年齡、手術(shù)術(shù)后的殘余灶、分期、分化、化療的療程、病理分型和生存時間，探討卵巢上皮癌中p－ERK的表達及其與腫瘤患者預后之間的相互關(guān)系。

材料和方法

1 材料

收集浙江醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院2001年1月～2008年12月符合本實驗要求患者共計142例。

所有組織置于液氮中快速冰凍，然后保存于－80℃冰箱中。

正常卵巢組:35例，年齡41～62歲(中位年齡51歲);良性卵巢組:35例(漿液性囊腺瘤20例、黏液性囊腺瘤15例)，年齡39～61歲(中位年齡50歲);卵巢上皮癌組:72例，年齡33～70歲(中位年齡52 歲)。組織學分級:G1，13 例;G2，26 例;G3，33例。臨床分期:I～II期21例，Ⅲ～Ⅳ期51例。病理類型:漿液性卵巢癌39例，未分化腺癌17例，黏液性卵巢癌6例，卵巢子宮內(nèi)膜樣癌10例。所有組織均經(jīng)浙江醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院病理科證實。卵巢上皮癌均為原發(fā)性卵巢腫瘤，術(shù)前無任何治療，術(shù)后均采用以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，其中療程大于或等于6個的有53例，小于6個的有19例。殘余灶直徑大于2 cm的有26例，小于2 cm的有46例。

自手術(shù)之日起為隨訪開始時間，收集卵巢上皮癌患者的年齡、FIGO分期、病理分級、術(shù)后殘余灶、化療的療程、病理類型以及生存時間，生存時間隨訪至2010年12月，納入實驗要求的卵巢癌患者均可隨訪。

2 主要試劑

小鼠抗大鼠p－ERK單克隆抗體(SC－7383)、化學發(fā)光試劑(sc－2048)購自Santa Cruz，辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(ZB－2305)購自北京中山生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物酶標記單克隆小鼠抗甘油醛－3－磷酸脫氫酶(GAPDH)購自上海康成生物工程有限公司，苯甲磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、抑肽酶(aprotinin)和亮肽素(leupeptin)購自Sigma，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜購自 Amersham，其余試劑均購自上海生物工程公司。

3 方法

3.1 樣品的獲取 切下約0.5 g新鮮凍存組織，剪碎后加入5倍體積的裂解液，其組成為:Tris－HCl 50 mmol·L－1(pH 8.0)，NaCl 150 mmol·L－1，乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetra－aceticacid，EDTA)0.5 mmol· L－1，二硫蘇糖醇 (dithiothreitol，DTT)1 mmol·L－1，NP －401%，脫氧膽酸鈉 0.5%，十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)0.1%，釩酸鈉100 μmol·L－1，PMSF 100 mg·L－1，抑肽酶 1 mg·L－1，亮肽素 2 mg·L－1，冰浴條件下進行組織勻漿，4℃、12000×g離心10 min，取上清，用Folin酚法進行蛋白定量后保存于－70℃。

3.2 Western blotting檢測p－ERK蛋白表達 取40 μg蛋白，加入上樣緩沖液煮沸3 min變性后按文獻報道的Western blotting方法［4］，完成十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)和蛋白轉(zhuǎn)膜操作，膜片與I抗(小鼠抗大鼠p－ERK單克隆抗體，稀釋濃度為1∶1000)進行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，再與辣根過氧化物酶標記II抗(山羊抗鼠IgG，稀釋濃度為1∶10000)反應(yīng)，經(jīng)適當洗滌，膜片與ECL溫浴1 min，保鮮膜包裹后，經(jīng)X光片曝光、顯影和定影。為平衡所用蛋白量，所有PVDF膜均經(jīng)洗脫后用辣根過氧化物酶結(jié)合的GAPDH抗體檢測GAPDH的表達。應(yīng)用Bio－Rad顯影儀和相應(yīng)圖像分析軟件程序光密度法定量檢測p－ERK和GAPDH蛋白信號。以p－ERK和相應(yīng)GAPDH蛋白信號的比值表示p－ERK的相對表達量。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。生存時間指從手術(shù)之日至任何原因所致的死亡時間。p－ERK水平采用均數(shù)±標準差()表示，生存時間采用中位數(shù)表示。多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，生存曲線繪制用Kaplan－Meier法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 卵巢組織中p－ERK水平比較

分別測定正常卵巢組織、良性卵巢組織、I～II期卵巢上皮癌組織、Ⅲ～Ⅳ期卵巢上皮癌組織中p－ERK含量。在正常卵巢組織和良性卵巢組織中p－ERK含量較低，兩者無明顯差異(P＞0.05)，I～II期卵巢上皮癌組織和Ⅲ～Ⅳ期卵巢上皮癌組織中p－ERK含量較高，與正常卵巢組織p－ERK含量相比，差異顯著(P＜0.01)，而且Ⅲ～Ⅳ期卵巢上皮癌組織中p－ERK含量明顯高于I～II期卵巢上皮癌，兩者相比有明顯差異(P＜0.01)，見圖1。

Figure 1.Expression of p－ERK in ovarian tissues from different groups..＊＊P＜0.01 vs normal.圖1 不同組別卵巢組織中p－ERK表達水平

2 不同病理分化卵巢上皮癌組織中p－ERK水平比較

在不同病理分化的卵巢上皮癌組織中，低分化卵巢上皮癌組織中p－ERK含量最高，高分化卵巢上皮癌組織中p－ERK含量最低，兩兩相比，均有顯著差異(P＜0.05)，見圖2。

3 不同病理類型卵巢上皮癌組織中p－ERK水平比較

不同病理類型卵巢上皮癌中，p－ERK水平不同。與漿液性卵巢上皮癌組織相比，腺癌組織中p－ERK含量與其相仿(P＞0.05)，而黏液性卵巢上皮癌、卵巢宮內(nèi)膜樣癌組織中p－ERK含量較低(P＜0.05)，見圖3。

Figure 2.Changes of p－ERK in ovarian cancer tissues with different pathological grades.G1:poorly － differentiated;G2:moderately－differentiated;G3:well－differentiated..*P＜0.05 vs G1.圖2 不同病理分化卵巢上皮癌組織中p－ERK的表達水平

Figure 3.Changes of p－ERK in ovarian cancer tissues with different pathological types.Lane 1:serous carcinoma of ovary(n=39);Lane 2:adenocarcinoma(n=17);Lane 3:endometrioid carcinoma of ovary(n=10);Lane 4:mucinous carcinoma of ovary(n=6)..*P ＜0.05vs serous carcinoma of ovary.圖3 不同病理類型卵巢上皮癌組織中p－ERK水平比較

4 卵巢上皮癌組織中p－ERK水平與生存時間的關(guān)系

根據(jù)p－ERK水平，將卵巢上皮癌患者分成3組，p－ERK ＜1.0組13例，1.0＜p－ERK ＜1.6組34例，p－ERK ＞1.6組25例。p－ERK ＜1.0組中位生存時間 60.0月(95%可信區(qū)間 53.4～66.6月);1.0＜p－ERK ＜1.6組中位生存時間 50.0月(95%可信區(qū)間38.1～61.9月);p－ERK＞1.6組中位生存時間 28.0月(95%可信區(qū)間 19.8～36.2月)。p－ERK水平越高的，生存時間越短，兩者呈負相關(guān)。兩兩相比，均有明顯差異(P＜0.01)，見圖4。

Figure 4.The correlation between p－ERK expression level in ovarian cancer tissues and survival time(n=72).圖4 卵巢上皮癌組織中p－ERK水平與生存時間的關(guān)系

5 多因素與生存時間的關(guān)系

采用多因素變量Cox回歸分析多因素與生存時間的關(guān)系，見圖5、表1。

Figure 5.Total survival curve(n=72).圖5 總的生存率曲線

表1 卵巢癌患者Cox比例風險模型多因素回歸分析結(jié)果Table 1.Multivariable Cox proportional hazards regression analysis of patients with ovarian cancer(n=72)

從表1可以看出，p－ERK含量、殘余灶、腫瘤分期、腫瘤分級以及化療療程均P＜0.05，說明卵巢上皮癌患者的生存時間與p－ERK含量、殘余灶、腫瘤分期、腫瘤分級以及化療療程有著密切關(guān)系。p－ERK含量越低，患者生存時間越長。而年齡、病理類型P＞0.05，無統(tǒng)計學意義，說明卵巢上皮癌患者的生存時間與患者的年齡、腫瘤的病理類型沒有相關(guān)性。

討 論

近年來，卵巢癌的發(fā)病率逐年上升，卻缺乏有效的診斷和治療方法，發(fā)現(xiàn)時多屬于晚期，手術(shù)、化療效果不佳。因此，研究導致卵巢上皮癌發(fā)生的分子發(fā)病機制，為卵巢癌的早期診斷和有效治療提供理論依據(jù)是十分重要的。

體外及動物實驗提示，ERK的激活與結(jié)腸癌、乳腺癌和前列腺癌等有關(guān)［5－6］，提示這一轉(zhuǎn)導通路的異?？赡芘c腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預后有關(guān)。ERK在卵巢上皮癌組織中有過高表達［7］，促性腺激素誘導卵巢腫瘤細胞遷移和增殖需要ERK激活［8］，ERK可被順鉑、紫杉醇、內(nèi)皮素1和促性腺激素釋放激素激活并調(diào)節(jié)［9－10］，這些均提示ERK信號轉(zhuǎn)導途徑在調(diào)節(jié)外界刺激對卵巢癌的細胞增殖、存活和凋亡方面有很重要的作用。但對于p－ERK含量與腫瘤分期、腫瘤分級以及病理類型是否有關(guān)尚不明確，p－ERK與生存時間的研究未見報道。

我們的實驗表明p－ERK在卵巢上皮癌中有過高表達，并且與卵巢上皮癌的分期、病理類型、病理分級有關(guān)。卵巢上皮癌組織中p－ERK含量明顯高于良性卵巢組織和正常卵巢組織，Ⅲ～Ⅳ期卵巢上皮癌組織中p－ERK含量明顯高于I～II期，良性卵巢組織中p－ERK含量與正常卵巢組織無顯著差異;低分化卵巢上皮癌組織中的p－ERK含量高于中、高分化。在不同病理類型卵巢癌中，與漿液性卵巢上皮癌組織相比，腺癌組織中p－ERK含量與其相仿，而黏液性卵巢上皮癌、卵巢宮內(nèi)膜樣癌組織p－ERK含量較低。不同臨床病理因素間p－ERK表達不同，其機制尚不明確。我們推測卵巢上皮癌，ERK信號途徑被某種因素刺激，參與了卵巢上皮癌細胞的增殖和分化，p－ERK表達隨著卵巢癌病程進展而增強。

迄今為止，仍未發(fā)現(xiàn)一種良好的預測卵巢上皮癌預后的生物學標志物［11］。晚期卵巢上皮癌的預后較差與多種因素有關(guān)。一般說來FIGO分期越晚、分化越低、術(shù)后殘余灶＞2 cm、療程越短，卵巢上皮癌的預后相對更差。在我們的實驗中，卵巢上皮癌患者的生存時間與p－ERK含量、殘余灶、腫瘤分期、腫瘤分級以及化療的療程有著密切關(guān)系，而腫瘤的病理類型沒有相關(guān)性。提示p－ERK含量在判斷卵巢上皮癌預后有著重要意義。

上述研究顯示:p－ERK含量在卵巢上皮癌中表達過高，可能是卵巢上皮癌發(fā)病機制一個重要的調(diào)節(jié)激酶，測定p－ERK水平可能對卵巢上皮癌患者預后有預測價值。

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