張繼剛 任 婧 萬 明 高繼鑫 李 巍 劉玉峰

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍皮膚病研究所，西安710032)

B細(xì)胞是機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要組成部分，根據(jù)其功能和在體內(nèi)存在部位的不同可分為B1細(xì)胞和B2細(xì)胞兩個亞群，脾臟中大多為B2細(xì)胞，而腹膜腔中大多為 B1細(xì)胞［1］。2008 年，Yanaba等［2］在正常小鼠脾臟中鑒定出一個具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能的B細(xì)胞亞群，其表型為CDldhiCD5+CD19hi，由于其免疫調(diào)節(jié)功能依賴于IL-10，又稱之為B10細(xì)胞。小鼠腹腔中也存在能夠通過產(chǎn)生IL-10而發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能的B細(xì)胞，由于未發(fā)現(xiàn)其具有特異性的表型標(biāo)志，這群細(xì)胞被稱之為腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞［3］，但也有研究者認(rèn)為在一定刺激下產(chǎn)生IL-10是B10細(xì)胞最好的標(biāo)志［4］，因此腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞也可稱之為腹腔B10細(xì)胞。目前關(guān)于腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞與B1細(xì)胞之間的關(guān)系尚不清楚，關(guān)于其的活化和成熟的信號特點(diǎn)也知之甚少，本研究對小鼠腹腔細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，給予不同的刺激，分析促進(jìn)小鼠腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的活化和成熟的信號特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級 BALB/c小鼠，雌雄各半，8～12周，購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 試劑與儀器 PE-anti-IL-10，PE/Cy5-anti-CD19，anti-CD16/CD32，莫能星(monensin)，PE-Rat IgG2b isotype control均購自eBioscience公司;anti-CD40、固定劑、破膜劑購自Biolegend公司;anti-IgM F(ab')2購自Jackson ImmunoResearch Laboratories;脂多糖(LPS)、離子霉素(Ionomycin)、佛波酯(PMA)購自Sigma公司;RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司;流式細(xì)胞儀為Beckman Coulter公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔細(xì)胞分離 小鼠斷頸處死，75%酒精浸泡消毒后仰面置于解剖板上，在下腹部剪開分離皮膚，暴露腹膜，腹白線處剪一小口，用槍頭打入1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)灌洗腹腔，輕輕揉捏腹部，彎頭滴管吸出灌洗液，置于10 ml離心管，離心管插于冰盒中，重復(fù)3次。1 000 r/min離心5分鐘，棄上清，加入1 ml RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞計數(shù)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取2×106細(xì)胞于24孔板，RPMI 1640培養(yǎng)基加至1 ml，分別培養(yǎng)5小時和48小時，培養(yǎng)5小時者每孔加入佛波酯(PMA，50 ng/ml)+離子霉素(Ionomycin，500 ng/ml)作為基礎(chǔ)刺激，莫能星(Monensin，2μmol/L)作為阻止IL-10向細(xì)胞外分泌的阻斷劑(即PIM 5小時)，再分別加入LPS(10 μg/ml)、soluble anti-IgM F(ab')2(10 μg/ml)、coated anti-IgM F(ab')2(10 μg/ml)、anti-CD40(1 μg/ml)刺激5小時。培養(yǎng)48小時者分別用LPS、soluble anti-IgM F(ab')2(10 μg/ml)、coated anti-IgM F(ab')2(10 μg/ml)、anti-CD40(1μg/ml)刺激48小時，最后5小時加入PIM。

其中coated anti-IgM F(ab')2為預(yù)包被anti-IgM F(ab')2刺激，用pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋anti-IgM F(ab')2，濃度為10μg/ml。加入24孔板，每孔300μl，4℃過夜后取出24孔板，小心吸去包被液，無菌PBS洗5遍，備用。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測 取1×106刺激后細(xì)胞于流式管，流式洗滌液1 500 ml洗滌2次(1 000 r/min離心，5分鐘)，加入封閉抗體anti-CD16/CD32 4℃15分鐘，流式洗滌液1 500 ml洗滌2次(1 000 r/min離心，5分鐘)。細(xì)胞懸液100μl加入PE/Cy5-anti-CD19 1μl，4℃下避光反應(yīng)30分鐘，洗滌2次(1 000 r/min離心，5分鐘)。將待測細(xì)胞加入固定劑，室溫避光20分鐘，400 r/min離心6分鐘。500 ml破膜劑洗滌3次(400 r/min離心，6分鐘)，細(xì)胞懸液100μl加入PE-anti-IL-10 1μl，室溫避光反應(yīng)20分鐘，500 ml破膜劑洗滌2次(400 r/min離心，6分鐘)，300 ml流式洗滌液重懸，流式細(xì)胞儀分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 用統(tǒng)計軟件SPSS10.0分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同體外刺激5小時對小鼠腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的影響 在不加任何刺激的情況下，小鼠腹腔IL-10+B細(xì)胞平均只占CD19+B細(xì)胞的1.53%，加入PIM后IL-10+B細(xì)胞比例明顯升高，達(dá)14.69%(P＜0.01)，在 PIM 刺激的基礎(chǔ)上加入soluble anti-IgM F(ab')2或anti-CD40均不能明顯提高小鼠腹腔B細(xì)胞IL-10的表達(dá)(P＞0.05)，而加入LPS后，IL-10的表達(dá)水平升高至平均26.53%，明顯高于PIM、soluble anti-IgM F(ab')2+PIM和anti-CD40+PIM 刺激組(P ＜0.01，圖1)。

圖1 不同體外刺激5小時對小鼠腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的影響Fig.1 The effect of different stimulation in vitro for 5 h on IL-10-producing B cells in peritoneal cavity of mice

圖2 不同體外刺激48小時對小鼠腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的影響Fig.2 The effect of different stimulation in vitro for 48 h on IL-10-producing B cells in peritoneal cavity of mice

圖3 不同強(qiáng)度anti-IgM刺激對小鼠腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的影響Fig.3 The effect of anti-IgM stimulation with different strength in vitro on IL-10-producing B cells in peritoneal cavity of mice

2.2 不同體外刺激48小時對小鼠腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的影響 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時，小鼠腹腔IL-10+B細(xì)胞平均占CD19+B細(xì)胞的1.66%，最后5小時加入PIM后IL-10+B細(xì)胞比例升高至16.24%(P ＜ 0.01)，soluble anti-IgM F(ab')2、anti-CD40和LPS刺激48小時，最后5小時加入PIM，小鼠腹腔IL-10+B細(xì)胞比例分別為20.43%、29.27%和38.16%。soluble anti-IgM F(ab')2刺激組 IL-10+B細(xì)胞比例略有升高(P＜0.05)，而anti-CD40和LPS刺激48小時均能明顯提高IL-10+B細(xì)胞比例(P ＜0.01，圖 2)。

2.3 不同強(qiáng)度anti-IgM刺激對小鼠腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的影響在體外刺激5小時的情況下，soluble anti-IgM F(ab')2對小鼠腹腔B細(xì)胞產(chǎn)生IL-10沒有明顯影響，而coated anti-IgM可抑制PIM對腹腔B細(xì)胞產(chǎn)生IL-10的活化作用(P＜0.05)。體外刺激48小時時，soluble anti-IgM F(ab')2對腹腔B細(xì)胞表達(dá)IL-10有輕度促進(jìn)作用，而coated anti-IgM明顯抑制腹腔B細(xì)胞產(chǎn)生IL-10(P＜0.01，圖3)。

3 討論

一般認(rèn)為B細(xì)胞通過產(chǎn)生抗體、遞呈抗原、提供協(xié)同刺激信號等發(fā)揮正向免疫應(yīng)答作用。1996年，Janeway及其同事［5］發(fā)現(xiàn)用混合完全氟氏佐劑的髓磷脂堿性蛋白(Myelin Basic Protein，MBP)免疫B細(xì)胞缺陷小鼠(μMT)所誘導(dǎo)的實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)比在正常小鼠誘導(dǎo)的EAE要嚴(yán)重得多，并且不象正常小鼠誘導(dǎo)的EAE那樣能自行緩解，分泌IL-10的B細(xì)胞的缺陷是造成μMT鼠EAE顯著加重的原因，由此真正開始了B細(xì)胞負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能的研究。1997年Bhan等［6］對B細(xì)胞在自身免疫性結(jié)腸炎中的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了分析，他們將μMT小鼠與能夠自發(fā)產(chǎn)生結(jié)腸炎的T細(xì)胞受體α鏈基因敲除小鼠(TCRα-/-)交配，子代小鼠自發(fā)產(chǎn)生的腸道炎癥出現(xiàn)更早且更嚴(yán)重，提示B細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在抑制炎癥反應(yīng)中具有重要作用，據(jù)此Bhan首次提出了“調(diào)節(jié)性B細(xì)胞”的概念。之后又在多種自身免疫性疾病的小鼠模型中驗證了調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的存在和功能，如Ⅰ型糖尿病、膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、接觸性超敏反應(yīng)等［7-11］。

小鼠脾臟B10細(xì)胞的鑒定是調(diào)節(jié)性B細(xì)胞研究領(lǐng)域的一個重要進(jìn)展，為進(jìn)一步研究其發(fā)育和功能特點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)［2］。同時研究者發(fā)現(xiàn)小鼠腹腔中也存在大量產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞，但關(guān)于這一群B細(xì)胞的表型特點(diǎn)及其與腹腔B1細(xì)胞的關(guān)系尚不明確，甚至是否這一群細(xì)胞也可稱之為B10細(xì)胞也還存在爭議，目前暫稱之為腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞，關(guān)于這一群細(xì)胞活化、成熟的信號特點(diǎn)還知之甚少。

一般認(rèn)為在5小時刺激時間，誘導(dǎo)B細(xì)胞表達(dá)IL-10是通過細(xì)胞活化實現(xiàn)的［12］，我們用 anti-IgM刺激模擬BCR信號，coated anti-IgM可更有效地誘導(dǎo)BCR交聯(lián)，可產(chǎn)生比soluble anti-IgM刺激更強(qiáng)的BCR信號，soluble anti-IgM和anti-CD40刺激對腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的活化無明顯作用，coated anti-IgM刺激反而抑制腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的活化。LPS+PIM是誘導(dǎo)腹腔B細(xì)胞表達(dá)IL-10的最佳刺激，表明固有免疫應(yīng)答的信號可能參與了腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的活化過程。

在體外刺激48小時時，促進(jìn)IL-10+B細(xì)胞比例升高主要是通過誘導(dǎo)其前體細(xì)胞成熟實現(xiàn)的［12，13］，延長刺激時間至 48 小時，LPS 和 anti-CD40刺激可大幅度增加小鼠腹腔IL-10+B細(xì)胞比例，soluble anti-IgM刺激可使腹腔B細(xì)胞IL-10的表達(dá)略有增加。而可產(chǎn)生更強(qiáng)BCR信號的coated anti-IgM可明顯抑制小鼠腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的前體細(xì)胞的成熟?？梢?，BCR信號在腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的活化和成熟過程中具有復(fù)雜的作用，具體發(fā)揮怎樣的作用依賴于作用時間和信號強(qiáng)度，其機(jī)制和意義尚有待于進(jìn)一步的研究。

關(guān)于腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞與腹腔B1細(xì)胞、脾臟B10細(xì)胞等之間的譜系關(guān)系尚無明確認(rèn)識，關(guān)于其發(fā)育、成熟、擴(kuò)增、活化的信號特點(diǎn)也知之甚少，發(fā)現(xiàn)腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的活化、成熟的信號特點(diǎn)，將為明確這些問題奠定基礎(chǔ)。

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