張繼剛 任 婧 萬 明 高繼鑫 李 巍 劉玉峰
(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍皮膚病研究所,西安710032)
B細(xì)胞是機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要組成部分,根據(jù)其功能和在體內(nèi)存在部位的不同可分為B1細(xì)胞和B2細(xì)胞兩個亞群,脾臟中大多為B2細(xì)胞,而腹膜腔中大多為 B1細(xì)胞[1]。2008 年,Yanaba等[2]在正常小鼠脾臟中鑒定出一個具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能的B細(xì)胞亞群,其表型為CDldhiCD5+CD19hi,由于其免疫調(diào)節(jié)功能依賴于IL-10,又稱之為B10細(xì)胞。小鼠腹腔中也存在能夠通過產(chǎn)生IL-10而發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能的B細(xì)胞,由于未發(fā)現(xiàn)其具有特異性的表型標(biāo)志,這群細(xì)胞被稱之為腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞[3],但也有研究者認(rèn)為在一定刺激下產(chǎn)生IL-10是B10細(xì)胞最好的標(biāo)志[4],因此腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞也可稱之為腹腔B10細(xì)胞。目前關(guān)于腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞與B1細(xì)胞之間的關(guān)系尚不清楚,關(guān)于其的活化和成熟的信號特點(diǎn)也知之甚少,本研究對小鼠腹腔細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),給予不同的刺激,分析促進(jìn)小鼠腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的活化和成熟的信號特點(diǎn)。
1.1 材料
1.1.1 實驗動物 SPF級 BALB/c小鼠,雌雄各半,8~12周,購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。
1.1.2 試劑與儀器 PE-anti-IL-10,PE/Cy5-anti-CD19,anti-CD16/CD32,莫能星(monensin),PE-Rat IgG2b isotype control均購自eBioscience公司;anti-CD40、固定劑、破膜劑購自Biolegend公司;anti-IgM F(ab')2購自Jackson ImmunoResearch Laboratories;脂多糖(LPS)、離子霉素(Ionomycin)、佛波酯(PMA)購自Sigma公司;RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司;流式細(xì)胞儀為Beckman Coulter公司產(chǎn)品。
1.2 方法
1.2.1 小鼠腹腔細(xì)胞分離 小鼠斷頸處死,75%酒精浸泡消毒后仰面置于解剖板上,在下腹部剪開分離皮膚,暴露腹膜,腹白線處剪一小口,用槍頭打入1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)灌洗腹腔,輕輕揉捏腹部,彎頭滴管吸出灌洗液,置于10 ml離心管,離心管插于冰盒中,重復(fù)3次。1 000 r/min離心5分鐘,棄上清,加入1 ml RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液重懸,細(xì)胞計數(shù)。
1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取2×106細(xì)胞于24孔板,RPMI 1640培養(yǎng)基加至1 ml,分別培養(yǎng)5小時和48小時,培養(yǎng)5小時者每孔加入佛波酯(PMA,50 ng/ml)+離子霉素(Ionomycin,500 ng/ml)作為基礎(chǔ)刺激,莫能星(Monensin,2μmol/L)作為阻止IL-10向細(xì)胞外分泌的阻斷劑(即PIM 5小時),再分別加入LPS(10 μg/ml)、soluble anti-IgM F(ab')2(10 μg/ml)、coated anti-IgM F(ab')2(10 μg/ml)、anti-CD40(1 μg/ml)刺激5小時。培養(yǎng)48小時者分別用LPS、soluble anti-IgM F(ab')2(10 μg/ml)、coated anti-IgM F(ab')2(10 μg/ml)、anti-CD40(1μg/ml)刺激48小時,最后5小時加入PIM。
其中coated anti-IgM F(ab')2為預(yù)包被anti-IgM F(ab')2刺激,用pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋anti-IgM F(ab')2,濃度為10μg/ml。加入24孔板,每孔300μl,4℃過夜后取出24孔板,小心吸去包被液,無菌PBS洗5遍,備用。
1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測 取1×106刺激后細(xì)胞于流式管,流式洗滌液1 500 ml洗滌2次(1 000 r/min離心,5分鐘),加入封閉抗體anti-CD16/CD32 4℃15分鐘,流式洗滌液1 500 ml洗滌2次(1 000 r/min離心,5分鐘)。細(xì)胞懸液100μl加入PE/Cy5-anti-CD19 1μl,4℃下避光反應(yīng)30分鐘,洗滌2次(1 000 r/min離心,5分鐘)。將待測細(xì)胞加入固定劑,室溫避光20分鐘,400 r/min離心6分鐘。500 ml破膜劑洗滌3次(400 r/min離心,6分鐘),細(xì)胞懸液100μl加入PE-anti-IL-10 1μl,室溫避光反應(yīng)20分鐘,500 ml破膜劑洗滌2次(400 r/min離心,6分鐘),300 ml流式洗滌液重懸,流式細(xì)胞儀分析。
1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 用統(tǒng)計軟件SPSS10.0分析,兩組間比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 不同體外刺激5小時對小鼠腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的影響 在不加任何刺激的情況下,小鼠腹腔IL-10+B細(xì)胞平均只占CD19+B細(xì)胞的1.53%,加入PIM后IL-10+B細(xì)胞比例明顯升高,達(dá)14.69%(P<0.01),在 PIM 刺激的基礎(chǔ)上加入soluble anti-IgM F(ab')2或anti-CD40均不能明顯提高小鼠腹腔B細(xì)胞IL-10的表達(dá)(P>0.05),而加入LPS后,IL-10的表達(dá)水平升高至平均26.53%,明顯高于PIM、soluble anti-IgM F(ab')2+PIM和anti-CD40+PIM 刺激組(P <0.01,圖1)。
圖1 不同體外刺激5小時對小鼠腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的影響Fig.1 The effect of different stimulation in vitro for 5 h on IL-10-producing B cells in peritoneal cavity of mice
圖2 不同體外刺激48小時對小鼠腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的影響Fig.2 The effect of different stimulation in vitro for 48 h on IL-10-producing B cells in peritoneal cavity of mice
圖3 不同強(qiáng)度anti-IgM刺激對小鼠腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的影響Fig.3 The effect of anti-IgM stimulation with different strength in vitro on IL-10-producing B cells in peritoneal cavity of mice
2.2 不同體外刺激48小時對小鼠腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的影響 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時,小鼠腹腔IL-10+B細(xì)胞平均占CD19+B細(xì)胞的1.66%,最后5小時加入PIM后IL-10+B細(xì)胞比例升高至16.24%(P < 0.01),soluble anti-IgM F(ab')2、anti-CD40和LPS刺激48小時,最后5小時加入PIM,小鼠腹腔IL-10+B細(xì)胞比例分別為20.43%、29.27%和38.16%。soluble anti-IgM F(ab')2刺激組 IL-10+B細(xì)胞比例略有升高(P<0.05),而anti-CD40和LPS刺激48小時均能明顯提高IL-10+B細(xì)胞比例(P <0.01,圖 2)。
2.3 不同強(qiáng)度anti-IgM刺激對小鼠腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的影響在體外刺激5小時的情況下,soluble anti-IgM F(ab')2對小鼠腹腔B細(xì)胞產(chǎn)生IL-10沒有明顯影響,而coated anti-IgM可抑制PIM對腹腔B細(xì)胞產(chǎn)生IL-10的活化作用(P<0.05)。體外刺激48小時時,soluble anti-IgM F(ab')2對腹腔B細(xì)胞表達(dá)IL-10有輕度促進(jìn)作用,而coated anti-IgM明顯抑制腹腔B細(xì)胞產(chǎn)生IL-10(P<0.01,圖3)。
一般認(rèn)為B細(xì)胞通過產(chǎn)生抗體、遞呈抗原、提供協(xié)同刺激信號等發(fā)揮正向免疫應(yīng)答作用。1996年,Janeway及其同事[5]發(fā)現(xiàn)用混合完全氟氏佐劑的髓磷脂堿性蛋白(Myelin Basic Protein,MBP)免疫B細(xì)胞缺陷小鼠(μMT)所誘導(dǎo)的實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)比在正常小鼠誘導(dǎo)的EAE要嚴(yán)重得多,并且不象正常小鼠誘導(dǎo)的EAE那樣能自行緩解,分泌IL-10的B細(xì)胞的缺陷是造成μMT鼠EAE顯著加重的原因,由此真正開始了B細(xì)胞負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能的研究。1997年Bhan等[6]對B細(xì)胞在自身免疫性結(jié)腸炎中的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了分析,他們將μMT小鼠與能夠自發(fā)產(chǎn)生結(jié)腸炎的T細(xì)胞受體α鏈基因敲除小鼠(TCRα-/-)交配,子代小鼠自發(fā)產(chǎn)生的腸道炎癥出現(xiàn)更早且更嚴(yán)重,提示B細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在抑制炎癥反應(yīng)中具有重要作用,據(jù)此Bhan首次提出了“調(diào)節(jié)性B細(xì)胞”的概念。之后又在多種自身免疫性疾病的小鼠模型中驗證了調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的存在和功能,如Ⅰ型糖尿病、膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、接觸性超敏反應(yīng)等[7-11]。
小鼠脾臟B10細(xì)胞的鑒定是調(diào)節(jié)性B細(xì)胞研究領(lǐng)域的一個重要進(jìn)展,為進(jìn)一步研究其發(fā)育和功能特點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)[2]。同時研究者發(fā)現(xiàn)小鼠腹腔中也存在大量產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞,但關(guān)于這一群B細(xì)胞的表型特點(diǎn)及其與腹腔B1細(xì)胞的關(guān)系尚不明確,甚至是否這一群細(xì)胞也可稱之為B10細(xì)胞也還存在爭議,目前暫稱之為腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞,關(guān)于這一群細(xì)胞活化、成熟的信號特點(diǎn)還知之甚少。
一般認(rèn)為在5小時刺激時間,誘導(dǎo)B細(xì)胞表達(dá)IL-10是通過細(xì)胞活化實現(xiàn)的[12],我們用 anti-IgM刺激模擬BCR信號,coated anti-IgM可更有效地誘導(dǎo)BCR交聯(lián),可產(chǎn)生比soluble anti-IgM刺激更強(qiáng)的BCR信號,soluble anti-IgM和anti-CD40刺激對腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的活化無明顯作用,coated anti-IgM刺激反而抑制腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的活化。LPS+PIM是誘導(dǎo)腹腔B細(xì)胞表達(dá)IL-10的最佳刺激,表明固有免疫應(yīng)答的信號可能參與了腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的活化過程。
在體外刺激48小時時,促進(jìn)IL-10+B細(xì)胞比例升高主要是通過誘導(dǎo)其前體細(xì)胞成熟實現(xiàn)的[12,13],延長刺激時間至 48 小時,LPS 和 anti-CD40刺激可大幅度增加小鼠腹腔IL-10+B細(xì)胞比例,soluble anti-IgM刺激可使腹腔B細(xì)胞IL-10的表達(dá)略有增加。而可產(chǎn)生更強(qiáng)BCR信號的coated anti-IgM可明顯抑制小鼠腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的前體細(xì)胞的成熟??梢?,BCR信號在腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的活化和成熟過程中具有復(fù)雜的作用,具體發(fā)揮怎樣的作用依賴于作用時間和信號強(qiáng)度,其機(jī)制和意義尚有待于進(jìn)一步的研究。
關(guān)于腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞與腹腔B1細(xì)胞、脾臟B10細(xì)胞等之間的譜系關(guān)系尚無明確認(rèn)識,關(guān)于其發(fā)育、成熟、擴(kuò)增、活化的信號特點(diǎn)也知之甚少,發(fā)現(xiàn)腹腔產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的活化、成熟的信號特點(diǎn),將為明確這些問題奠定基礎(chǔ)。
1 LeBien T W,Thomas F T.B-lymphocytes:how they develop and function[J].Blood,2008;112(5):1570-1579.
2 Yanaba K,Bouaziz J D,Haas K M et al.A regulatory B cell subset with a unique CD1dhiCD5+phenotype controls T cell-dependent inflammatory responses[J].Immunity,2008;28(5):639-650.
3 Jean-David Bouaziz,Koichi Yanaba,Thomas F T.Regulatory B cells as inhibitors of immune responses and inflammation[J].Immunol Rev,2008;224:201-214.
4 Paul A B,Lina Yassin Norena,F(xiàn)abian Flores-Borja et al.CD19+CD24highCD38highB cells exhibit regulatory capacity in healthy individuals but are functionally impaired in systemic lupus erythematosus patients[J].Immunity,2010;32(1):129-140.
5 Wolf S D,F(xiàn)ridrika B D,Hardardottir F et al.Experimental autoimmune encephalomyelitis induction in genetically B cell-deficient mice[J].JExp Med,1996;184(6):2271-2278.
6 Mizoguchi A,Mizoguchi E,Smith N R et al.Suppressive role of B cells in chronic colitis of T cell receptor alpha mutant mice[J].JExp Med,1997;186(10):1749-1756.
7 Hussain S,Delovitch T L.Intravenous transfusion of BCR-activated B cells protects NOD mice from type 1 diabetes in an IL-10-dependent manner[J].J Immunol,2007;179(11):7225-7232.
8 Blair PA,Chavez-Rueda K A,Evans JG et al.Selective targeting of B cells with agonistic anti-CD40 is an efficacious strategy for the generation of induced regulatory T2-like B cells and for the suppression of lupus in MRL/lpr mice[J].J Immunol,2009;182(6):3492-3502.
9 Evans J G,Chavez-Rueda K A,Eddaoudi A et al.Novel suppressive function of transitional 2 B cells in experimental arthritis[J].JImmunol,2007;178(12):7868-7878.
10 Karen M Haas,Rei Watanabe,Takashi Matsushita et al.Protective and pathogenic roles for B cells during systemic autoimmunity in NZB/W F1 mice[J].J Immunol,2010;184(9):4789-4800.
11 Watanabe R,F(xiàn)ujimoto M,Ishiura N et al.CD19 expression in B cells is important for suppression of contact hypersensitivity[J].Am J Pathol,2007;171(2):560-570.
12 Yanaba K,Bouaziz J D,Matsushita T et al.The development and function of regulatory B cells expressing IL-10(B10 cells)requires antigen receptor diversity and TLR signals[J].JImmunol,2009;182(12):7459-7472.
13 Haas K M,Watanabe R,Matsushita T et al.Protective and pathogenic roles for B cells during systemic autoimmunity in NZB/WF1 mice[J].J Immunol,2010;184(9):4789-4800.