劉培培 王洪芳 呂 品 王少雄 (上海澤潤生物科技有限公司分析制劑室，上海201203)

酶聯(lián)免疫斑點(Enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)技術(shù)是20世紀80年代中期出現(xiàn)，并逐漸發(fā)展和完善起來的一種能夠從單細胞水平檢測特異性抗體分泌細胞和特異性細胞因子分泌細胞的免疫技術(shù)，具有較高的穩(wěn)定性、敏感性和特異性。目前，該技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于疫苗和藥品的檢測、自身免疫疾病的檢測、病毒以及腫瘤研究、結(jié)核病高危人群的篩查以及各種免疫性疾病的研究和檢測［1，2］;干細胞功能分析;B細胞雜交瘤檢測，藥物免疫學反應和抗原表位肽的篩選等。國家藥審中心要求:“在評價細胞免疫效價時，應當建立檢測評價細胞免疫的方法(如特異性CTL反應的方法或ELISPOT方法等”。IFN-γ是由Th1細胞亞群分泌的一類細胞因子，能夠促進CTL、NK細胞及巨噬細胞的活化和增殖介導的細胞毒效應。因此建立IFN-γELISPOT檢測方法，可以作為檢測和評價疫苗細胞免疫的有效方法。雖然ELISPOT技術(shù)已經(jīng)被廣泛應用于機體免疫功能的測定，但是該技術(shù)尚未完全標準化，其陽性判定標準各不相同，因此在ELISPOT方法建立與應用過程中，這方面仍需要進一步的探討。

本文以本公司自制的融合蛋白疫苗，免疫C57BL/6小鼠，從免疫途徑、免疫劑量、細胞濃度以及肽刺激濃度等方面確立了檢測該融合蛋白疫苗誘導的特異性IFN-γ的ELISPOT方法，為該疫苗的細胞免疫研究提供了一種準確、靈敏、特異的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要實驗材料 C57BL/6小鼠，6～8周齡，雌性，SPF級，上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產(chǎn)許可證號:SYXK(滬)2008-0058;無熱原的融合蛋白疫苗、樣品稀釋液(無熱原的空白佐劑溶液)由本公司制備;淋巴細胞分離液、無血清培養(yǎng)基為達科為公司產(chǎn)品;RPMI1640、FBS為Gibco公司產(chǎn)品;刀豆蛋白(ConA)為Sigma公司產(chǎn)品;Mouse-IFN-γ ELISPOT kit、AEC kit為 BD 公司產(chǎn)品;刺激肽為上海生工合成產(chǎn)品，純度＞95%。

1.2 方法

1.2.1 小鼠免疫 將C57BL/6小鼠隨機分為實驗組和對照組，實驗組腹部皮下注射疫苗，注射量為0.5 ml/只，免疫濃度為 30 μg/ml，對照組每只注射0.5 ml的樣品稀釋液，14天后，加強免疫一次。

1.2.2 脾淋巴細胞分離 C57BL/6小鼠加強免疫14天后，摘眼球取血并處死，無菌取脾，置于3 ml淋巴細胞分離液中，在200目的篩網(wǎng)中研磨成單個細胞懸液，轉(zhuǎn)移細胞懸液至15 ml的離心管中，在細胞懸液上輕輕覆蓋一層1640培養(yǎng)基，2 000 r/min離心30分鐘，吸取淋巴細胞層，用無菌PBS溶液清洗2次，無血清培養(yǎng)基重懸細胞，臺酚藍染色并進行細胞計數(shù)。

1.2.3 ELISPOT實驗步驟 按照試劑盒說明書要求，稀釋捕獲抗體，100μl/孔，4℃包被過夜。次日傾倒包被液，無菌PBS洗滌3遍，再用含10%FBS的1640培養(yǎng)基進行封閉，200μl/孔，室溫封閉2小時;棄封閉液，加入脾淋巴細胞，100μl/孔，實驗孔加入刺激肽，陰性對照孔中不加刺激物，ConA作為陽性對照，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)一段時間;傾倒培養(yǎng)基，以200μl/孔冰冷的去離子水，4℃冰浴20分鐘裂解細胞;用PBST洗板4次，加入檢測抗體，100μl/孔，室溫避光孵育1小時;PBST洗板4次，加入酶標親和素，100μl/孔，室溫避光孵育1小時;用PBST洗板3次、再用PBS洗板2次，加入底物顯色液，100μl/孔，室溫下避光顯色15～20分鐘;去離子水終止色反應，CTL S5 Versa斑點分析儀進行斑點計數(shù)。

1.2.4 ELISPOT 方法的建立

1.2.4.1 免疫途徑的選擇 將C57BL/6小鼠隨機分為6組，每組7只，比較3種免疫途徑，分別為皮下注射、肌肉注射、腹腔注射，給藥量為0.5 ml/只，免疫濃度為30μg/ml，各免疫途徑相應的對照組每只注射0.5 ml的樣品稀釋液。14天后，加強免疫一次，于第28天，頸部脫臼處死小鼠，無菌取脾，分離淋巴細胞，計數(shù)，將脾淋巴細胞濃度調(diào)整至3×106個/ml，100 μl/孔種于 ELISPOT 板，加入刺激肽，1μg/孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)40小時后，進行ELISPOT檢測。

1.2.4.2 細胞培養(yǎng)時間的選擇 隨機抽取實驗組小鼠、對照組小鼠各5只，無菌取脾，分離淋巴細胞，計數(shù)，將脾淋巴細胞濃度分別調(diào)整至3×106個/ml，100μl/孔種于 ELISPOT板，加入刺激肽，1μg/孔，陰性對照孔不加刺激物，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)，于12、24、48和72小時，進行ELISPOT檢測。

1.2.4.3 細胞濃度的選擇 隨機抽取實驗組小鼠5只，無菌取脾，分離淋巴細胞，計數(shù)，將脾淋巴細胞濃度分別調(diào)整至2 ×106、3 ×106、4 ×106、5 ×106、6 ×106個/ml，100 μl/孔種于 ELISPOT 板，加入刺激肽，1 μg/孔，陰性對照孔不加刺激物，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)40小時后，進行ELISPOT檢測。

1.2.4.4 特異性肽刺激濃度的選擇 隨機抽取實驗組、對照組小鼠各5只，無菌取脾，分離淋巴細胞，計數(shù)，將脾淋巴細胞濃度調(diào)整至4×106個/ml，100 μl/孔種于ELISPOT板，用培養(yǎng)基對刺激肽進行稀釋，按照 0.125、0.25、0.5、1、2、4 和 8 μg/孔的刺激量分別加入，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)40小時后，進行ELISPOT檢測。

1.2.5 融合蛋白疫苗誘導的細胞免疫效應檢測

將C57BL/6小鼠隨機分為6組，每組8只，其中5組為實驗組，另外一組為對照組。將疫苗用樣品稀釋液進行梯度稀釋，濃度分別為:120、30、7.5、1.8和0.46μg/ml，分別按組給藥，每個濃度為一組，注射量為0.5 ml/只，對照組每只注射0.5 ml的樣品稀釋液。14天后，加強免疫一次，于第28天，頸部脫臼處理動物，無菌取脾，分離淋巴細胞，計數(shù)，將脾淋巴細胞濃度調(diào)整至4×106個/ml，100μl/孔種于ELISPOT 板，加入刺激肽，1 μg/孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)40小時后，進行ELISPOT檢測。

2 結(jié)果

2.1 ELISPOT試驗結(jié)果分析 圖1中的每一個斑點代表一個分泌IFN-γ的T淋巴細胞(Spot forming cell，SFC)，斑點數(shù)與該孔細胞總數(shù)的比值即為分泌IFN-γ的T淋巴細胞比率，該比率的高低反映著機體的IFN-γ水平和機體細胞免疫效應的強度。

陽性判斷標準:參考文獻［3-5］并結(jié)合本研究的實際情況，設(shè)定抗原刺激孔的斑點數(shù)大于55個斑點/106個細胞，且大于4倍的陰性對照孔的斑點數(shù)。每個實驗組中陽性小鼠的只數(shù)與每組小鼠總數(shù)的比值為免疫陽轉(zhuǎn)率，該比率的高低反映該疫苗細胞免疫強度。

2.2 動物免疫途徑的確定 由圖2結(jié)果可知，在30μg/ml免疫濃度下，皮下注射免疫效果最佳，平均斑點數(shù)最多，腹腔注射次之，而肌肉注射免疫效果不佳，3種免疫方式相應的對照組，均呈陰性反應。從3種免疫途徑的比較結(jié)果看，選擇皮下注射作為該疫苗的最佳小鼠免疫方式。

2.3 細胞培養(yǎng)時間的確定 由圖3的結(jié)果可知，在刺激肽的作用下，實驗組小鼠特異性分泌IFN-γ的脾淋巴細胞數(shù)隨著培養(yǎng)時間的增加而遞增，對照組小鼠非特異性分泌IFN-γ的脾淋巴細胞數(shù)在48小時前無明顯變化，維持在一定水平，但在48小時后顯著增強，達到40多個斑點。在無刺激肽作用下，實驗組小鼠分泌IFN-γ的脾淋巴細胞數(shù)隨著培養(yǎng)時間的增加呈現(xiàn)一定的遞增趨勢，但幅度很小，最高可到12個/孔;對照組小鼠則無明顯變化，一直維持在5～10個/孔。由此可知，在刺激肽作用下，細胞培養(yǎng)時間控制在24～48小時范圍內(nèi)比較合適。

2.4 細胞濃度的確定 由圖4可知，斑點數(shù)隨著脾淋巴細胞濃度的增加而增加，當脾淋巴細胞濃度為4×105個/孔時，實驗組小鼠脾淋巴細胞形成的特異性斑點數(shù)平均達到75個/孔，對照組小鼠脾淋巴細胞形成的非特異性斑點數(shù)較少，平均斑點數(shù)為12個/孔，本底干擾小。當脾淋巴細胞濃度小于3×105個/孔時，斑點數(shù)太少，小于20個/孔，實驗誤差就會增大;當細胞濃度大于4×105個/孔時，對照組小鼠脾淋巴細胞形成的非特異性斑點數(shù)逐步升高，大于40個/孔，本底干擾大，影響結(jié)果判斷。所以最佳細胞濃度為4×105個/孔。

圖1 IFN-γELISPOT斑點形成照片F(xiàn)ig.1 Spot forming pictures of IFN-γ ELISPOT

圖2 不同免疫途徑下小鼠細胞免疫強度比較Fig.2 Effects of different immunization routes

圖3 培養(yǎng)時間對IFN-γ分泌的影響Fig.3 Effects of culture time on the IFN-γ secretion

圖4 脾淋巴細胞濃度對IFN-γ分泌的影響Fig.4 Effects of cells concentration on the IFN-γ secretion

圖5 肽刺激濃度對IFN-γ分泌的影響Fig.5 Effects of peptide concentration on the IFN-γ secretion

表1 融合蛋白疫苗誘導的細胞免疫量效關(guān)系檢測結(jié)果Tab.1 The results of the fusion protein vaccine-induced cellular immune response

圖6 疫苗誘導的細胞免疫強度量效關(guān)系Fig.6 Dose effect relation of the fusion protein vaccine

2.5 肽刺激濃度的確定 由圖5可知，在0.125～2μg/孔的肽刺激濃度范圍內(nèi)，實驗組小鼠形成的特異性斑點數(shù)隨肽刺激濃度的增加而增加，當肽刺激濃度為4μg/孔，斑點數(shù)減少;而對照組小鼠的非特異性斑點數(shù)隨著肽刺激濃度的增加一直維持遞增的趨勢，通過綜合比較，肽刺激濃度選擇0.5～2μg/孔的范圍比較合適，實驗選擇1μg/孔作為最佳肽刺激量，在此濃度下，實驗組小鼠特異性分泌IFN-γ的脾淋巴細胞形成的斑點數(shù)較多，而對照組小鼠形成的非特異性斑點較低，本底干擾較小。

2.6 融合蛋白疫苗誘導的細胞免疫效應檢測 隨著疫苗免疫濃度的逐漸增加，特異性分泌IFN-γ的T淋巴細胞形成的斑點數(shù)也逐漸增加，當免疫劑量為30μg/ml時，平均斑點數(shù)最高，陽轉(zhuǎn)率也最大，達到75%;當濃度繼續(xù)升高時，平均斑點數(shù)有所減少。由于動物個體差異以及動物機體對于藥物的敏感程度各有差異，所以同組間小鼠特異性分泌IFN-γ的T淋巴細胞形成的斑點總數(shù)有一定的差異，組間偏差較高，結(jié)果見表1。對照組小鼠均呈陰性反應。將免疫濃度取Log值，用Graphpad prism軟件進行Log免疫濃度-陽轉(zhuǎn)率的劑量曲線擬合，結(jié)果見圖6，曲線擬合參數(shù) R2＞0.95，EC50值為 6.6 μg/ml，曲線擬合較佳，根據(jù)EC50值的大小，可以評價該融合蛋白疫苗的細胞免疫強度。

3 討論

近年來，在免疫學研究領(lǐng)域中，對于疾病以及疫苗研究不僅僅局限于體液免疫應答，細胞介導的免疫應答也逐漸為人們所關(guān)注。在研究細胞免疫應答保護作用及其機理方面，酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT)是近幾年發(fā)展起來的一項非常實用的細胞免疫學檢測技術(shù)，它結(jié)合了細胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)的長處，能夠分析經(jīng)特異性抗原活化后分泌細胞因子(如 IFN-γ、TNF-α等)的單個效應細胞的頻數(shù)，具有敏感性高，易操作，特異性好的優(yōu)點，能從2×105～3×105細胞中檢出1個分泌細胞因子的細胞，實驗證明其敏感性比ELISA法高10～200倍［6］，這些獨特優(yōu)點都使得 ELISPOT技術(shù)成為國際公認的檢測抗原反應性效應細胞的實驗方法之一。

本研究通過對免疫途徑、脾淋巴細胞濃度、細胞孵育時間、抗原刺激濃度等條件的摸索，建立了一種由本公司自制的融合蛋白疫苗誘導的特異性細胞免疫的IFN-γELISPOT檢測方法，用以評價該融合蛋白疫苗誘導的細胞免疫應答效應。實驗通過比較皮下、腹腔、肌肉三種注射方式的免疫效果，選擇皮下注射方式作為該疫苗的最佳小鼠免疫方式;合適的脾淋巴細胞濃度直接影響結(jié)果的判斷，細胞濃度過低時，形成的斑點數(shù)量少，使檢測的敏感度降低，過高的細胞濃度又會導致背景太深，非特異性干擾增加影響斑點計數(shù)，綜合考慮，本研究選擇4×105個/孔作為脾淋巴細胞鋪板濃度;細胞孵育時間的長短是本研究重要的影響因素之一，合適的細胞孵育時間既要滿足檢測的敏感度，又要排除非特異性斑點的干擾，通過實驗比較本研究選擇24～48小時作為脾淋巴細胞孵育時間;抗原刺激濃度是另一個重要的實驗影響因素，本研究選擇針對該融合蛋白疫苗特異性刺激肽作為抗原刺激物，經(jīng)過實驗結(jié)果的綜合比較選擇0.5～2μg/孔作為該肽段的刺激濃度范圍，在該濃度范圍內(nèi)，實驗組小鼠特異性分泌IFN-γ的脾淋巴細胞形成的斑點數(shù)較多，而對照組小鼠形成的非特異性斑點低，本底干擾小。以系列梯度稀釋的融合蛋白疫苗對小鼠進行免疫，從實驗結(jié)果中可知，當免疫劑量為30μg/ml時，免疫組小鼠脾淋巴細胞經(jīng)過抗原刺激后，形成的平均斑點數(shù)最高，陽轉(zhuǎn)率也最大，以Log免疫濃度-陽轉(zhuǎn)率進行曲線擬合，可得EC50值，根據(jù)EC50值的大小，可以評價該融合蛋白疫苗的細胞免疫強度。

在ELISPOT數(shù)據(jù)分析方面，常選用兩種分析方法進行結(jié)果處理，其中一種為通過比較不同免疫組的平均斑點數(shù)的多少，判斷藥物細胞免疫強度;另外一種方法是選擇合適的陽性判斷標準，計算陽轉(zhuǎn)率來評價藥物細胞免疫強度。本文對兩種數(shù)據(jù)處理方法進行了比較，當采用平均斑點數(shù)進行數(shù)據(jù)分析時，如果組間小鼠個體差異不大時，結(jié)果具有可比性，但是如果同組中有1～2只小鼠給藥后應激反應較為強烈，形成較多的特異性斑點，這種個體差異將會導致平均斑點數(shù)大幅度提高，增加了結(jié)果的變異性，影響組間結(jié)果的判斷。然而采用陽轉(zhuǎn)率進行數(shù)據(jù)分析時，則可以避免因為機體個體差異而導致的實驗誤差和結(jié)果判斷的不準確性。因此，選擇一個合適且嚴謹?shù)年栃耘袛鄻藴史浅Ｖ匾?，一定要結(jié)合實驗自身的情況進行大量數(shù)據(jù)分析，經(jīng)過統(tǒng)計分析比較后，再進行選擇。

本文建立的ELISPOT方法能夠用于檢測該融合蛋白疫苗誘導的特異性IFN-γ，評價疫苗的細胞免疫效應，該方法操作簡單，能夠從單細胞水平上進行細胞因子的檢測，是一種高效、靈敏、特異的免疫學檢測方法。

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