方 成 李 琦 劉 立 陳 薇 胡漢寧 梁慧芳 王加謀 瞿永華 謝德芳

(武漢工業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)院移植免疫實(shí)驗(yàn)室，武漢430023)

慢性排斥導(dǎo)致免疫損害是異體移植物失功的主要原因［1］。主要組織相容性抗原(MHC)是異體移植排斥反應(yīng)的主要靶抗原，但是在慢性移植排斥的病人中，還可能存在針對自身抗原的免疫反應(yīng)。本研究關(guān)注移植后新發(fā)的自身免疫反應(yīng)，而非復(fù)發(fā)的自身免疫疾病。臨床資料顯示腎移植后病人可產(chǎn)生針對集聚蛋白(agrin)、熱休克蛋白60(Hsp60)等抗原的多種自身免疫抗體［2-4］。而vimentin特異性自身反應(yīng)CD8+T細(xì)胞在心臟移植病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)［5］。因此對移植后并發(fā)自身免疫反應(yīng)的研究，有助于全面理解慢性免疫損害導(dǎo)致的移植物失功能。

vimentin是一種細(xì)胞中間絲骨架蛋白，廣泛存在于內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞［5］。本試驗(yàn)在觀察大鼠慢性移植腎腎病(CAN)進(jìn)程的基礎(chǔ)上，檢測自身抗原vimentin特異性細(xì)胞免疫(IFN-γ分泌T細(xì)胞)和體液免疫(特異性抗體)的發(fā)生及強(qiáng)度變化，確定vimentin是否腎移植后自身免疫靶抗原，探討腎移植后自身免疫反應(yīng)的特征。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑 雄性近交系F344(RT11v1)和Lewis(RT11)大鼠，12～15周齡，體質(zhì)量220～250 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司提供(許可證號(hào)SCXK京2006-0009)，20℃ ～24℃/12小時(shí)光照條件下標(biāo)準(zhǔn)鼠糧飼養(yǎng)。重組大鼠vimentin蛋白購自英國Cytoskeleton公司，大鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(ELISPOT)試劑盒購自荷蘭U-Cytec公司，PVDF膜96孔板為Millipore美國公司產(chǎn)品，辣根過氧化物酶標(biāo)記(HRP)山羊抗大鼠IgG購自美國Santa Cruze公司，TMB顯色劑購自碧云天公司，刀豆素A購自達(dá)科為公司。

1.2 大鼠腎移植模型及分組 Lewis大鼠左腎被F344大鼠供腎取代，7天后行右側(cè)腎切除術(shù)，受體不使用免疫治療可長期存活，建立經(jīng)典慢性排斥腎移植模型［6］。慢性排斥組(n=12)在術(shù)后第 14、49、98天處死4只收獲腎臟、脾臟及血清行病理及免疫檢測，未干預(yù)Lewis大鼠作為正常對照(n=3)。Lewis大鼠自體腎移植作為移植耐受組(n=3)，在術(shù)后第98天獲腎臟、脾臟、血清作檢測。

1.3 腎功能檢測 術(shù)后14天始收集尿液進(jìn)行腎功能檢測，每2周檢測1次。受體代謝籠內(nèi)禁食可隨意飲水，收集24小時(shí)。尿總蛋白濃度(g/L)以考馬斯亮藍(lán)法，尿肌酐濃度(mmol/L)以苦味酸法，使用美國Abbott公司Aeroset全自動(dòng)生化分析儀測定。蛋白尿指標(biāo)依照以下公式計(jì)算［7］:蛋白尿(g/mmol)=尿蛋白(g/L)/尿肌酐(mmol/L)。

1.4 組織病理檢查 慢性移植腎腎病(CAN)的評(píng)定參照05年修訂 Banff 97標(biāo)準(zhǔn)［8，9］。大鼠腎臟以4%甲醛固定，石蠟切片進(jìn)行HE、PAS和Masson染色，以腎間質(zhì)和腎小管纖維化程度為評(píng)級(jí)指標(biāo)，腎小球和血管硬化情況作為輔助觀測。腎小管、腎間質(zhì)的慢性損害程度以0～3分評(píng)定，無纖維化改變?yōu)?分，受累面積≤25%、≤50%、＞50%分別為1、2、3分。每個(gè)標(biāo)本100倍鏡下雙盲觀測5個(gè)視野，取平均值。

1.5 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT) 無菌收獲受體脾臟，將脾臟研磨通過200目不銹鋼濾網(wǎng)。裂解紅細(xì)胞后，有核細(xì)胞以PBS清洗兩次，細(xì)胞重懸于RPMI1640培養(yǎng)基。PVDF膜96孔板以5μg/ml抗大鼠IFN-γ捕獲抗體4℃包埋過夜。清洗該板后以含3%牛血清白蛋白的PBS液37℃封閉1小時(shí)。為檢測IFN-γ分泌性T細(xì)胞反應(yīng)，每孔3×105個(gè)脾細(xì)胞在完全RPMI1640培養(yǎng)基中孵育36小時(shí)，使用vimentin抗原(10μg/ml)刺激。以加入等體積PBS作為陰性對照，加入刀豆素A作為陽性對照。中止孵育洗板后，加入2μg/ml生物素標(biāo)記的抗大鼠IFN-γ檢測抗體，37℃孵育2小時(shí)。再以10%小牛血清PBS稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，37℃孵育1小時(shí)。洗板后，加入底物AEC顯色15分鐘。顯色斑點(diǎn)用美國CTL公司Immuno Spot分析儀分析。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 為檢測大鼠血清中的抗vimentin抗體，先以vimentin蛋白(10μg/ml)4℃包埋ELISA板過夜，僅加入PBS作為對照孔。洗板并以3%牛血清白蛋白封閉后，加入稀釋大鼠血清樣本(1/25)37℃孵育2小時(shí)。洗板后加入HRP標(biāo)記山羊抗大鼠IgG抗體檢測，最終加入底物TMB顯色20分鐘，用美國Bio-Rad公司iMARK酶標(biāo)儀讀取415 nm吸光度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析使用Prism(4.00)軟件。數(shù)值用±s表示。多組間數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析，輔以指定兩組間秩和檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)分析使用雙側(cè)比較，P＜0.05則差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 慢性排斥移植腎功能逐漸衰竭 正常大鼠及自體腎移植組的蛋白尿水平穩(wěn)定在(0.03～0.05)g/mmol。慢性排斥腎移植組蛋白尿水平在2～6周略有升高，維持于(0.15 ～0.20)g/mmol。術(shù)后8 周蛋白尿水平明顯上升，達(dá)到(0.42±0.17)g/mmol。第10 周和第12 周時(shí)分別為(0.81 ±0.37)g/mmol、(0.87 ± 0.36)g/mmol，腎功能已出現(xiàn)顯著損害(P ＜0.05，圖1)。

2.2 慢性排斥移植腎逐漸發(fā)生CAN 自體移植腎在98天時(shí)無腎病病理改變。F344-Lewis移植腎在49天出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化(1.2±0.2)、腎小管萎縮(1.5±0.3)、腎小球硬化，呈現(xiàn)典型的 CAN 病理改變。至第98天時(shí)移植腎體積已明顯萎縮，外表粗糙，鏡下可發(fā)現(xiàn)廣泛的腎間質(zhì)纖維化(2.2±0.2)、腎小管萎縮(2.5±0.3)及腎血管內(nèi)膜增厚(見圖2)。

2.3 同種腎移植受體出現(xiàn)vimentin反應(yīng)性T細(xì)胞

圖1 同種腎移植大鼠受體蛋白尿動(dòng)態(tài)檢測Fig.1 The proteinuria levels of rat recipients with renal allograft

圖2 同種大鼠移植腎組織學(xué)改變(HE×200)Fig.2 Light microscopic examination of renal allograft(HE×200)

收獲受體脾臟細(xì)胞體外培養(yǎng)，以vimentin為刺激物檢測特異性IFN-γ分泌T細(xì)胞的數(shù)量。術(shù)后14天慢性排斥組vimentin反應(yīng)性T細(xì)胞數(shù)量增加，在腎移植后49天其數(shù)量明顯增多(28.3±2.0 vs.10.1±2.1)，98 天時(shí)其數(shù)量急劇上升，與對照孔有非常顯著性差異(126.0 ±10.4 vs.26.3 ±4.1，P ＜0.01，見圖3)。在自體腎移植組，術(shù)后98天未發(fā)現(xiàn)vimentin特異性IFN-γ分泌T細(xì)胞。

2.4 同種腎移植受體vimentin抗體水平升高 在腎移植慢性排斥組，腎移植后14、49和98天收獲受體血清，體外檢測vimentin反應(yīng)性抗體水平(見圖4)，術(shù)后14天時(shí)vimentin抗體水平比正常鼠顯著升高(0.230 ±0.018 vs.0.063 ±0.008，P ＜0.05)，術(shù)后49天及98 天持續(xù)上升(0.257 ±0.031，0.350 ±0.017)。而自體腎移植大鼠術(shù)后98天檢測vimentin抗體水平無明顯改變。

圖3 腎移植大鼠vimentin反應(yīng)性IFN-γ分泌T細(xì)胞數(shù)量Fig.3 The frequencies of vimentin-specific IFN-γ secreting T cells from rat recipients

圖4 同種腎移植大鼠受體vimentin特異性IgG抗體水平變化Fig.4 The production of vimentin-specific IgG antibodies in rat recipients with renal allograft at different time points

3 討論

慢性移植物失功能是各種移植器官后期丟失的主要原因。移植腎腎病、移植肺支氣管肺炎、移植肝肝硬化等導(dǎo)致各種移植器官的功能衰竭，最終使受體再次面臨生命威脅［10-12］。慢性移植腎腎病的臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性腎功能減退、蛋白尿和高血壓，最終腎功能衰竭。其組織學(xué)表現(xiàn)為腎間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮、腎小球硬化和小動(dòng)脈內(nèi)膜炎等病理改變。有數(shù)據(jù)顯示慢性移植腎腎病術(shù)后6個(gè)月發(fā)生率達(dá)34.8%，術(shù)后 5 年發(fā)生率高達(dá) 60%［13，14］。急性排斥反應(yīng)、慢性排斥反應(yīng)、原有腎病復(fù)發(fā)、缺血再灌注損傷等作為慢性移植腎腎病的高風(fēng)險(xiǎn)因素受到關(guān)注［10-14］。

但腎移植后繼發(fā)自身免疫反應(yīng)的現(xiàn)象卻不容忽視，這種自身免疫限定為移植后新發(fā)的自身免疫反應(yīng)，而非復(fù)發(fā)的自身免疫疾病。臨床資料顯示在伴有CAN的長期存活受體內(nèi)可產(chǎn)生針對多種自身抗原的抗體，類似的情況在臨床肺臟、肝臟、胰腺移植中均存在［2-4，15-17］。已發(fā)現(xiàn)的人體腎移植后自身反應(yīng)性組織蛋白有agrin、Hsp60等，例如在44%(6/17)的移植后腎小球腎炎病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)針對腎小球基底膜上肝素硫酸化蛋白多糖Agrin的抗體［3］。作者也曾在同種腎移植大鼠體內(nèi)檢測到自身組織蛋白megalin(脂蛋白受體家族成員)抗體的持續(xù)存在［18］。對移植后繼發(fā)的自身免疫及相關(guān)抗原的研究，是全面理解慢性移植物損害不可或缺的部分。

在本實(shí)驗(yàn)大鼠同種腎移植慢性排斥模型中，術(shù)后49天時(shí)出現(xiàn)明顯蛋白尿及腎纖維化，發(fā)生典型CAN病變，并逐漸加重。觀察針對自體抗原的特異性細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，是評(píng)價(jià)移植后自身免疫的有效方法。vimentin是一種中間絲骨架蛋白，廣泛表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，在腎小管、腎血管內(nèi)皮及間質(zhì)細(xì)胞有豐富表達(dá)，是一種保守的自身組織抗原［5］。本實(shí)驗(yàn)中自身組織蛋白vimentin特異性IgG抗體在移植后14天即出現(xiàn)，抗體水平較正常大鼠有顯著性差異，其后抗體水平逐漸升高;而vimentin特異性IFN-γ分泌性T細(xì)胞數(shù)量在49天出現(xiàn)明顯升高，98天時(shí)數(shù)量急劇上升。大鼠同種腎移植慢性排斥模型發(fā)生了自身免疫反應(yīng)并逐漸增強(qiáng)，vimentin是腎移植后繼發(fā)自身免疫反應(yīng)的靶抗原。

同種移植組在98天時(shí)抗vimentin細(xì)胞及體液免疫均呈現(xiàn)顯著反應(yīng)，而在自體腎移植組術(shù)后98天未檢測到抗vimentin抗體及細(xì)胞，可以判斷異體排斥損害是發(fā)生移植后自身免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)因素。有實(shí)驗(yàn)研究肺部注射MHCⅠ類抗原的抗體，即可誘發(fā)肺臟自身組織抗原的免疫反應(yīng)［19］。

抗vimentin抗體在術(shù)后14天即顯著升高，而vimentin特異性IFN-γ分泌性T細(xì)胞數(shù)量在早期未見顯著升高，提示早期vimentin抗體的產(chǎn)生并非初次應(yīng)答?？梢栽O(shè)想在異體排斥導(dǎo)致的固有免疫活化及vimentin抗原決定簇持續(xù)暴露條件下，禁忌的自身反應(yīng)B細(xì)胞重新活化，在移植早期即產(chǎn)生高水平IgG抗體。記憶性B細(xì)胞產(chǎn)生抗體及遞呈抗原的能力，在自身抗原反應(yīng)強(qiáng)化過程中或許發(fā)揮著重要的誘導(dǎo)作用。

有實(shí)驗(yàn)研究從移植肺浸潤細(xì)胞中分離出膠原蛋白Ⅴ(CollagenⅤ)的自身免疫T細(xì)胞 ，能表達(dá)IL-17和IL-23輔助免疫反應(yīng)［20］。移植前誘導(dǎo)的 vimentin自身免疫可以加重移植心臟慢性損害［21］。本實(shí)驗(yàn)中vimentin特異性IFN-γ分泌T細(xì)胞數(shù)量在腎移植49天后急劇增加，顯示腎移植后自身免疫細(xì)胞反應(yīng)可能在后期發(fā)揮更強(qiáng)烈的作用。vimentin自身反應(yīng)性T細(xì)胞的大量出現(xiàn)，及高水平vimentin自身抗體的持續(xù)存在，表明自身免疫反應(yīng)在腎移植受體可以被全面激活，而vimentin是腎移植后自身免疫的有效抗原。對移植后繼發(fā)自身免疫導(dǎo)致移植腎損害程度進(jìn)行獨(dú)立評(píng)估，是有待進(jìn)一步研究的課題。

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