周健祥 王革非 蔣治武 曾 俊 蘇 蕓 李康生

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室廣東高校免疫病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，汕頭515041)

流感急性腦病(Influenza acute encephalopathy，IAE)是流感病毒感染的重要并發(fā)癥之一，患者在病毒感染后在呼吸道癥狀出現(xiàn)1～2天內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)為快速發(fā)展的認(rèn)知障礙、精神狀態(tài)改變、意識(shí)消退、昏迷等，嚴(yán)重時(shí)引起神經(jīng)后遺癥或死亡，其中A型流感病毒H3亞型比H1亞型和B型流感病毒，有更高的發(fā)病率［1-3］。流感急性腦病患者中80%左右為5歲以下兒童，死亡率約30%，此外約有25%的患兒會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)后遺癥。目前，IAE的發(fā)病機(jī)制依然不明。在流感相關(guān)腦病病人的腦脊液(CSF)和血漿中，發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1等促炎癥細(xì)胞因子的濃度升高［4，5］。認(rèn)為腦病可能是因機(jī)體在感染流感病毒后釋放促炎癥因子，進(jìn)而誘導(dǎo)了細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成CNS發(fā)生以促炎癥因子和趨化因子過(guò)度釋放為特征的細(xì)胞因子風(fēng)暴，引發(fā)神經(jīng)及免疫系統(tǒng)功能紊亂和CNS的免疫病理?yè)p傷［6-8］。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)細(xì)胞因子的重要來(lái)源，其數(shù)量占腦內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的50%以上，對(duì)神經(jīng)元起支持和營(yíng)養(yǎng)作用［9］，直接影響神經(jīng)元的存活，通過(guò)調(diào)節(jié)谷氨酸的攝取和釋放，以及清除自由基、水分運(yùn)輸，產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子和一氧化氮來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境，對(duì)維持腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)，血腦屏障穩(wěn)定舉足輕重［10-13］。而作為神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞在眾多神經(jīng)退行性病變中發(fā)揮重要功能，如帕金森癥、多發(fā)性硬化癥和阿茨海默癥等。小膠質(zhì)細(xì)胞是促炎性因子的主要來(lái)源，早期研究證實(shí)，過(guò)度激活小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)引起神經(jīng)毒性作用［14］。而近期研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活亦可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，如吞噬死亡的神經(jīng)元、清除代謝廢物［15］。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)流感病毒可以感染星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，并造成大量促炎細(xì)胞因子和趨化因子釋放［16］。而由流感病毒感染膠質(zhì)細(xì)胞所釋放的大量細(xì)胞因子對(duì)正常膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)功能有何影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究利用人流感病毒H1N1和H3N2感染小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞獲得條件上清，利用條件上清刺激正常星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，檢測(cè)相關(guān)促炎細(xì)胞因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄水平，為研究IAE所伴隨的細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)放大及細(xì)胞因子風(fēng)暴提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1至2日齡無(wú)特異病原(Specific Pathogen Free，SPF)的BALB/c小鼠由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 流感病毒毒株 人A型流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)和A/Shantou/602/2006(H3N2)。流感病毒在MDCK細(xì)胞進(jìn)行初步增殖收獲病毒母液，病毒為本室保存。經(jīng)空斑法測(cè)定病毒滴度，-80℃保存。

1.3 新生小鼠大腦皮層神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng) 將1至2天新生小鼠大腦皮層組織取出，使用巴斯德吸管于DMEM/F12(1∶1，v/v)培養(yǎng)基中吹打至組織團(tuán)塊分散成單個(gè)細(xì)胞，用200目濾網(wǎng)過(guò)濾得到細(xì)胞懸液。37℃放置30分鐘，去除貼壁的成纖維細(xì)胞。未貼壁細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后第2天和第4天，棄去未貼壁的細(xì)胞，更換培養(yǎng)基。以后每7天更換一次培養(yǎng)基，至混合膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)成單層(約21天)。

1.4 小鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞的分離 長(zhǎng)成單層的混合膠質(zhì)細(xì)胞用DMEM/F12稀釋的胰酶(2∶1，v/v)37℃作用約7分鐘，將含有星形膠質(zhì)細(xì)胞的胰酶液經(jīng)血清終止、離心后重懸培養(yǎng)。貼壁24小時(shí)后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶固定于定軌搖床(上海智誠(chéng))中37℃、200 r/min、水平震蕩2小時(shí)，棄懸浮細(xì)胞，加入含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS，杭州四季青)的DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco)繼續(xù)培養(yǎng)1天后，按上述方法再次進(jìn)行震蕩分離，得到純化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞。

長(zhǎng)成單層的混合膠質(zhì)細(xì)胞用0.08%胰酶37℃作用約15分鐘，鏡下觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞脫落后，棄去消化液，使用預(yù)熱DMEM/F12漂洗2遍加入胰酶消化液(0.25%trypsin/0.02%EDTA，Invitrogen)37℃作用5～10分鐘，得到小膠質(zhì)細(xì)胞組分，經(jīng)終止、離心后用10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.5 星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞的純度鑒定 膠質(zhì)細(xì)胞纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)是星形膠質(zhì)細(xì)胞的表面特異性標(biāo)志，CD11b是小膠質(zhì)細(xì)胞的表面特異性標(biāo)志，利用間接免疫熒光法對(duì)分離后的小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行純度鑒定。

1.6 流感病毒感染星形膠質(zhì)細(xì)胞 按照每孔1×105個(gè)細(xì)胞，將星形膠質(zhì)細(xì)胞接種于十二孔板，細(xì)胞貼壁24小時(shí)后，用500μl含有2×105pfu流感病毒(H1N1和H3N2)的病毒液感染，感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection，MOI)為 2，37℃吸附 1 小時(shí)。吸附結(jié)束后，每孔加入 500μl無(wú)血清 DMEM/F12，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)立未感染孔為陰性對(duì)照。感染后6小時(shí)和24小時(shí)收集上清液，經(jīng)超濾分子截留(PALL，300 kD)去除流感病毒顆粒后，獲得條件上清，用于刺激正常星形細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。陰性對(duì)照孔上清采用相同方法處理。

1.7 條件上清刺激正常膠質(zhì)細(xì)胞 按照每孔1×105個(gè)細(xì)胞，分別將星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞接種于十二孔板，細(xì)胞貼壁24小時(shí)后，使用預(yù)熱DMEM/F12培養(yǎng)基漂洗3遍，每孔加入500μl條件上清，對(duì)照孔加入陰性對(duì)照上清，培養(yǎng)24小時(shí)。

1.8 膠質(zhì)細(xì)胞RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 刺激后的膠質(zhì)細(xì)胞，使用 Trizol(Invitrogen)提取細(xì)胞的RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA含量。取1μg的RNA，用M-MLV first stand kit試劑盒(Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄，采用試劑盒自帶隨機(jī)引物，反應(yīng)體系為20μl。操作步驟按照Invitrogen公司說(shuō)明書，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA用于Real-Time-PCR反應(yīng)。

1.9 條件上清刺激正常膠質(zhì)細(xì)胞后炎癥相關(guān)因子的 Real-Time PCR 檢 測(cè) 使 用 Platinum○RSYBR○RGreen qPCR SuperMix-UDG(Invitrogen)試劑盒，對(duì)TNF-α、IL-6、IL-1β、IP-10(Interferon-gamma-Inducible Protein)、MCP-1(Monocyte Chemoattractant Protein)、MIP-1(Macrophage Inflammatory Protein)、GDNF(Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)，以 β-actin作為內(nèi)參，引物為 QIAGEN公司產(chǎn)品。反應(yīng)體系為20μl，操作步驟按照Invitrogen公司說(shuō)明書，使用ABI7300熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠膠質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 圖1所示，通過(guò)溫和胰酶分離和物理分離相結(jié)合的方法可得到純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，利用不同濃度胰酶的分步消化可得到純化的小膠質(zhì)細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞用GFAP為細(xì)胞特異性標(biāo)志進(jìn)行檢測(cè)，小膠質(zhì)細(xì)胞選用細(xì)胞特異性表面標(biāo)志CD11b進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。細(xì)胞均出現(xiàn)特異性的熒光染色，相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞或一抗缺失樣品則沒(méi)有熒光出現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的純度均超過(guò)95%。

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)條件上清刺激正常膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平上調(diào) 使用Real-Time PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)條件刺激小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞后，促炎因子 TNF-α、IL-1β、IL-6，趨化因子 IP-10、MCP-1、MIP-1及膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源營(yíng)養(yǎng)因子GDNF的表達(dá)變化情況。以 β-actin作為內(nèi)參，反應(yīng)體系為20 μl，每種細(xì)胞因子設(shè)立3 個(gè)復(fù)孔，使用 2-△△Ct法，計(jì)算目的基因表達(dá)量的變化。進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，獲得目的基因表達(dá)量變化平均值，基因表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖2、3。由圖2的結(jié)果表明:以星形膠質(zhì)細(xì)胞作為刺激對(duì)象，不同時(shí)間點(diǎn)的條件上清均能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子、趨化因子及膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源營(yíng)養(yǎng)因子轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，其中IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平變化程度最高，6小時(shí)條件上清刺激后其上調(diào)水平，分別為對(duì)照組的555.97倍和1 303.71倍。6小時(shí)條件上清比24小時(shí)條件上清，可以誘發(fā)更強(qiáng)的TNF-α、IL-6、IL-1β三種促炎因子的表達(dá)(P＜0.05)。所檢測(cè)的三種趨化因子中，IP-10上調(diào)程度高于MCP-1、MIP-1。膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源營(yíng)養(yǎng)因子GDNF的表達(dá)也發(fā)生了上調(diào)，但是不同時(shí)間點(diǎn)、不同病毒株來(lái)源的條件上清刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞后，其表達(dá)量之間無(wú)顯著差異。

圖1 混合膠質(zhì)、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)(×200)Fig.1 Isolation and culture of mixed glia cells，microglia，and astrocytes(×200)

圖2 條件上清刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞后細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.2 The transcript levels of cytokines of conditioned supernatant stimulated astrocytes

圖3 條件上清刺激小膠質(zhì)細(xì)胞后細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.3 The transcript levels of cytokines of conditioned supernatant stimulated microglia cells

圖3結(jié)果表明:以小膠質(zhì)細(xì)胞作為刺激對(duì)象，不同時(shí)間點(diǎn)的條件上清均能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子、趨化因子，膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源營(yíng)養(yǎng)因子轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，其中IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平變化程度最高，值得注意的是，不同毒株的條件上清引起小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)TNF-α的變化趨勢(shì)，與其他因子的表達(dá)趨勢(shì)相反，H1N1來(lái)源6小時(shí)條件上清刺激小膠質(zhì)細(xì)胞后，TNF-α表達(dá)量高于24小時(shí)來(lái)源上清(P＜0.05)，而同種條件上清造成其他細(xì)胞因子的表達(dá)變化與其相反;H3N2來(lái)源6小時(shí)條件上清刺激小膠質(zhì)細(xì)胞后，TNF-α表達(dá)量低于24小時(shí)來(lái)源條件上清(P＜0.05)，而同種條件上清造成其他細(xì)胞因子的表達(dá)變化與其相反，其中可能與流感病毒攻擊星形膠質(zhì)細(xì)胞后，所釋放的細(xì)胞因子特點(diǎn)存在關(guān)聯(lián)。

3 討論

目前，流感相關(guān)腦病的發(fā)病機(jī)制依然不明。細(xì)胞因子風(fēng)暴可能是致病機(jī)制之一，病毒感染患者后，激活固有免疫系統(tǒng)，造成促炎細(xì)胞因子的大量表達(dá)，伴隨著過(guò)度分解蛋白和脂肪，產(chǎn)生有毒物質(zhì)，隨著血液循環(huán)，誘發(fā)肝、腎損傷，繼而出現(xiàn)全身多器官衰竭;而血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和實(shí)質(zhì)細(xì)胞的凋亡會(huì)直接導(dǎo)致腦水腫和急性腦炎［1］。大量文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞因子風(fēng)暴的主要特點(diǎn)是產(chǎn)生和分泌大量的、多種類的、超過(guò)正常生理水平的促炎癥細(xì)胞因子，而高致病性禽流感H5N1的重要特征即可引起細(xì)胞因子風(fēng)暴，其中TNF-α、IL-6、IFN-γ是引起細(xì)胞因子風(fēng)暴的主要因子［17-19］。本實(shí)驗(yàn)室之前已經(jīng)證明流感病毒H1N1和H5N1可感染星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞分泌大量促炎因子和趨化因子，并造成細(xì)胞凋亡［16］。

因此，在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究流感病毒感染星形膠質(zhì)細(xì)胞后，所釋放的細(xì)胞因子對(duì)正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞造成的生理病理影響，為以后進(jìn)一步研究流感相關(guān)腦病的病理機(jī)制提供依據(jù)。本研究利用人流感病毒感染小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞后，獲得去除病毒顆粒的條件上清，刺激正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，利用Real-Time PCR檢測(cè)促炎因子、趨化因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。以星形膠質(zhì)細(xì)胞作為刺激對(duì)象，不同時(shí)間點(diǎn)的條件上清均能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子、趨化因子、膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源營(yíng)養(yǎng)因子轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，其中IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平變化程度最高，6小時(shí)條件上清比24小時(shí)條件上清，可以誘發(fā)更強(qiáng)的TNF-α、IL-6、IL-1β 三種促炎因子的表達(dá)(P ＜0.05)。以小膠質(zhì)細(xì)胞作為刺激對(duì)象，不同時(shí)間點(diǎn)的條件上清均能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子、趨化因子、膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源營(yíng)養(yǎng)因子轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，其中IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平變化程度最高，IL-6的轉(zhuǎn)錄水平變化情況與IL-1β變化情況類似。有趣的是，不同毒株的條件上清引起小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)TNF-α的變化趨勢(shì)，與其他因子的表達(dá)趨勢(shì)相反，其中可能與流感病毒攻擊星形膠質(zhì)細(xì)胞后，所釋放的細(xì)胞因子特點(diǎn)存在關(guān)聯(lián)，可能為后期探尋發(fā)揮關(guān)鍵功能的因素提供線索。

流感病毒感染神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致促炎因子、趨化因子表達(dá)上調(diào)外［16］，本研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的大量細(xì)胞因子可對(duì)正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生級(jí)聯(lián)效應(yīng)。不同時(shí)間點(diǎn)的條件上清刺激神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，相關(guān)促炎因子、趨化因子的變化水平不同，其可能原因是，不同時(shí)間點(diǎn)條件上清中所含細(xì)胞因子的種類，濃度不同。即流感病毒感染星形膠質(zhì)細(xì)胞后，細(xì)胞因子的分泌情況具有階段性特征［16］。臨床上治療流感相關(guān)腦病的手段主要是低溫、抗炎治療［20，21］。Kawashima等［22］報(bào)道，3例 IAE患者采用甲基強(qiáng)的松龍沖擊療法和血漿置換，去除細(xì)胞因子后，恢復(fù)良好無(wú)嚴(yán)重后遺癥。Nancy Yuk-Yu Ip的研究小組，使用高致病性禽流感H5N1攻擊人星型膠質(zhì)和神經(jīng)元細(xì)胞系，可直接造成細(xì)胞損傷，并且使用高劑量IL-6和TNF-α重組蛋白分別刺激細(xì)胞后，相關(guān)促炎細(xì)胞因子、趨化因子轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生上調(diào)，與IL-6相比較，TNF-α可更加顯著誘導(dǎo) caspase3表達(dá)［23］。2009年暴發(fā)的新型H1N1大流感，患急性呼吸窘迫癥的患者常并發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴，IL-6、TNF-α、IL-10起主要作用，患者血清中的IL-6、IL-10，腦脊液中IL-6的表達(dá)水平與神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥嚴(yán)重程度密切相關(guān)［5］。以本實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，探索條件上清中引起級(jí)聯(lián)效應(yīng)的關(guān)鍵因子，找到有效抑制或降低級(jí)聯(lián)效應(yīng)的方法，維持腦內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定，可為治療流感相關(guān)腦病提供策略。

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