鄒家瓊 楊國珍 敬 鵬 羅昭遜

1.貴陽醫(yī)學院醫(yī)學檢驗系，貴州 貴陽 550004；2.川北醫(yī)學院檢驗系，四川 南充 637000；3.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院小兒外科，四川 南充 637000

ΔNp63是p63基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物之一，在結(jié)構(gòu)上與p53具有高度的相似性，屬于p53家族，主要表達于表皮、宮頸、泌尿系統(tǒng)等具有鱗狀上皮分化潛能的基底細胞和旁基底細胞。最新的研究報道[1-2]，ΔNp63基因在上皮源性腫瘤中改變了腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移作用。ΔNp63在各不同組織學類型的子宮頸癌中高表達，且與腫瘤的分級相關(guān)[3]。這提示ΔNp63在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要的作用。為研究ΔNp63基因在宮頸癌中遷移、侵襲的機制，本研究針對人ΔNp63基因設(shè)計并合成小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）干擾此基因的表達，同時在體外進行觀察ΔNp63基因?qū)eLa細胞遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌細胞株HeLa細胞購于中國科學院上海細胞庫；pGeneSil-1質(zhì)粒購于武漢晶賽公司；lipofectamineTM2000購于Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒購于Omega公司。RPMI-1640購于武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清購于TBD公司。小鼠抗人ΔNp63多克隆抗體、小鼠抗人GAPDH單克隆抗體及兔抗小鼠IgG-HRP二抗均購于Santa Cruz公司。10×SDS-PAGE電泳緩沖液以及SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購于上海寶曼生物科技有限公司；PVDF膜購于Millipore 公司；其他試劑如：DEPC、MTT、G418、DMSO 等均購自Sigma公司。Transwell細胞培養(yǎng)小室購自Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的設(shè)計、合成和標記 在GenBank查找人源ΔNp63基因序列，根據(jù)siRNA設(shè)計原則，并參考文獻[4-5]，設(shè)計針對ΔNp63基因靶點的特異性寡核若酸序列，其序列為：AATGCCCAGACTCAATTTAGT；陰性對照siRNA是沒有靶基因的無關(guān)對照小RNA。GFP標記的siRNA和陰性對照siRNA。以上序列均由武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 細胞培養(yǎng)、瞬時轉(zhuǎn)染及細胞分組 HeLa細胞在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，規(guī)范換液傳代。轉(zhuǎn)染前利用胰酶消化收集細胞，將細胞按1×104個細胞/孔接種于6孔板。當細胞生長密度達到50%～70%時，采用lipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染24 h后通過倒置熒光顯微鏡觀察HeLa細胞綠色熒光蛋白的表達情況。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，將細胞分為4組：空白對照組（未轉(zhuǎn)染的HeLa細胞），空載體組（只轉(zhuǎn)脂質(zhì)體的HeLa細胞），陰性質(zhì)粒組（轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照的HeLa細胞），干擾質(zhì)粒組（轉(zhuǎn)染有陽性轉(zhuǎn)染率的siRNA的HeLa細胞）。

1.2.3 Real-time PCR檢測ΔNp63 mRNA的表達水平 轉(zhuǎn)染后的HeLa細胞再培養(yǎng)48 h，利用胰酶消化收集細胞，按RNA提取試劑盒說明書中步驟提取各轉(zhuǎn)染組HeLa細胞的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；應(yīng)用Real-time PCR檢測ΔNp63的mRNA表達水平。根據(jù)ΔNp63的cDNA序列設(shè)計引物，其上游引物為：5'-TGCGCAGACTCAATTTAGTGAG-3'，下游引物：5'-TCTGGATGGCGCATGTCTTTGC-3'。以 β-actin 作為內(nèi)參，依據(jù)β-actin的cDNA序列設(shè)計引物，其上游引物為：5'-TGACGTGGACATCCGCTAAG-3'， 下游引物：5'-CTGGAAGGTGGACAGCCAGG-3'。以上引物皆由武漢晶賽生物工程 技術(shù)有限公司合成。 反應(yīng)條件：94℃ 4 min；94℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)35次，72℃檢測信號。根據(jù)標準曲線計算ΔNp63的相對值。

1.2.4 Western blot檢測ΔNp63的蛋白表達 轉(zhuǎn)染后的HeLa細胞再培養(yǎng)48 h，利用胰酶消化收集細胞，用細胞裂解液提取細胞總蛋白，蛋白樣本經(jīng)變性后，10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加1∶200小鼠抗人ΔNp63抗體和1∶3 000小鼠抗人GAPDH單克隆抗體，4℃孵育12 h。12 h后TBST漂洗，加1∶5 000兔抗小鼠IgG-HRP二抗，室溫下孵育3 h，采用化學法曝光、顯影。分析條帶灰度值。

1.2.5 Transwell侵襲實驗 采用強廷會等[6]的方法；預先用30 μg/mL 的 Matrigel膠 50 μL 處理 Transwell小室。 HeLa細胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后，常規(guī)消化收集細胞。然后在侵襲小室的上部分別加入各組細胞100 μL（105），在侵襲小室的下部加入800 μL的10%FBS液，在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵化24 h。取出Transwell小室，去除小室上表面的細胞，4%多聚甲醛固定小室下表面的細胞20 min，用臺盼藍染色。光鏡下記數(shù)穿過小室的HeLa細胞數(shù)，每組細胞各取5個視野計算其平均值。

1.2.6 同質(zhì)黏附實驗 將HeLa細胞接種于48孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)至融合為單層細胞；棄培養(yǎng)液，37℃預熱RPMI640，PBS沖洗去除懸浮細胞；RPMI640培養(yǎng)液重懸各組細胞至濃度為1×105個/mL，48孔板每孔加入 200 μL 重懸液，37℃培養(yǎng) 120 min，吸出培養(yǎng)液，用PBS洗細胞2次后計數(shù)未黏附細胞，每組重復4次；同質(zhì)黏附細胞數(shù)=加入的細胞數(shù)-未黏附細胞數(shù)。

1.2.7 異質(zhì)黏附實驗 依照Barbieri CE的細胞黏附性實驗方法，將轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后的HeLa細胞1×105個/mL加入預先鋪上Ⅳ膠原的96孔板中，在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，PBS清洗并吸除未黏附的細胞，滴加濃度為5 mg/mL的 MTT 20 μL，室溫下孵育 20 min，吸出 MTT 并滴入 200 μL的DMSO，用Bio-Rad酶聯(lián)免疫檢測儀測定其在590 nm處測吸光度A值，每組重復檢測6次計算其平均值。

1.3 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用snk檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA-ΔNp63對HeLa細胞ΔNp63 mRNA表達的影響

采用RT-PCR法測定ΔNp63 mRNA表達水平，結(jié)果顯示：在內(nèi)參β-actin表達一致的條件下，陰性質(zhì)粒組與空載體組細胞ΔNp63的mRNA表達水平與空白對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；而干擾質(zhì)粒組細胞中ΔNp63 mRNA的表達水平明顯降低（P<0.05）。見表1。

表1 siRNA-ΔNp63對HeLa細胞ΔNp63 mRNA表達水平的影響（）

表1 siRNA-ΔNp63對HeLa細胞ΔNp63 mRNA表達水平的影響（）

注：Ct值為每個PCR反應(yīng)管中熒光信號達到設(shè)定域值時經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；與其他組比較，aP<0.05，bP<0.05，cP<0.05

組別 β-actin平均Ct值 ΔNp63平均Ct值 ΔNp63相對值正常細胞組空載體組陰性質(zhì)粒組干擾質(zhì)粒組20.344±0.318 21.255±0.192 20.532±0.303 20.653±0.314 23.568±0.259 22.577±0.161 22.512±0.258 23.422±0.315 0.438±0.012a 0.411±0.008b 0.263±0.010c 0.155±0.006*

2.2 siRNA-ΔNp63對HeLa細胞的ΔNp63蛋白表達水平的影響

Western-blot分析顯示，干擾質(zhì)粒組細胞ΔNp63蛋白表達量（0.243±0.021）明顯低于空白對照組（0.891±0.002）（P<0.05）， 而空載體組 （0.878±0.011） 和陰性質(zhì)粒組 （0.746±0.003）與空白對照組細胞（0.891±0.002）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 見圖 1。

圖1 siRNA-ΔNp63對HeLa細胞的ΔNp63蛋白表達水平的影響

2.3 siRNA-ΔNp63干擾質(zhì)粒對HeLa細胞侵襲能力的影響

四組細胞穿膜的細胞數(shù)分別為 （25.4±1.2）、（26.5±1.5）、（24.3±1.2）、（10.3±1.7）個。經(jīng)統(tǒng)計學分析顯示，空白對照組、空載體組和陰性質(zhì)粒組三組之間的細胞穿膜數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；而干擾質(zhì)粒組穿過Matrigel基質(zhì)膠濾膜的細胞數(shù)較其余三組明顯減少（P<0.05）。見圖2。

圖2 Transwell侵襲實驗結(jié)果

2.4 siRNA-ΔNp63干擾質(zhì)粒對HeLa細胞同質(zhì)黏附性的影響

陰性質(zhì)粒組與空白對照組比較，二者同質(zhì)黏附細胞數(shù)無明顯差異，而siRNA-ΔNp63干擾質(zhì)粒組分別與空白對照組和陰性質(zhì)粒組比較，同質(zhì)黏附細胞數(shù)明顯增加。見表2。

表2 ΔNp63干擾質(zhì)粒對HeLa細胞同質(zhì)黏附的影響

2.5 siRNA-ΔNp63干擾質(zhì)粒對HeLa細胞異質(zhì)黏附性的影響

細胞異質(zhì)黏附性實驗提示，siRNA-ΔNp63組細胞的異質(zhì)黏附性與空白對照組、空載體和陰性質(zhì)粒組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而空載體和陰性質(zhì)粒組細胞的異質(zhì)黏附性與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖3。

3 討論

p63基因是Yang等[7]在1998年發(fā)現(xiàn)的與p53同源的基因，由于轉(zhuǎn)錄起始的不同而分為TAp63和ΔNp63兩個亞型。ΔNp63在腫瘤中起癌基因作用[8-9]。近期研究表明，ΔNp63基因通過對侵襲、轉(zhuǎn)移進行調(diào)節(jié)而影響腫瘤的發(fā)展[1,10-11]。

本研究采用脂質(zhì)體法將siRNA-ΔNp63干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HeLa細胞中。然后通過RT-PCR和Western-blot測定ΔNp63的表達，結(jié)果顯示siRNA-ΔNp63干擾質(zhì)粒明顯降低HeLa細胞中ΔNp63的表達，這一結(jié)果表明siRNA-ΔNp63質(zhì)粒成功抑制HeLa細胞中ΔNp63基因的表達。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤特征性的生物學行為，也是致患者死亡的主要原因。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移機制復雜，包括腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)黏附、降解基底膜和穿透基底膜是腫瘤細胞侵襲的三個重要環(huán)節(jié)[12]。因此，基底膜是阻止癌細胞侵襲、遷移的天然屏障。測定細胞穿透基底膜的能力可評估其侵襲能力。在本研究中，筆者通過MTT法檢測在590 nm處的吸光度來反映腫瘤細胞的異質(zhì)黏附性同時采用細胞計數(shù)法檢測腫瘤細胞間的同質(zhì)黏附性，結(jié)果提示siRNA-ΔNp63干擾質(zhì)粒明顯減弱HeLa細胞遷移能力。同時，通過Transwell侵襲實驗來檢測siRNA-ΔNp63干擾質(zhì)粒對HeLa細胞侵襲能力的改變，結(jié)果顯示，穩(wěn)定表達siRNA-ΔNp63干擾質(zhì)粒的HeLa細胞在體外與陰性質(zhì)粒組和空載體組比較，穿透侵襲能力明顯減弱。

圖3 細胞黏附實驗各組細胞的平均吸光度值

通過本課題組的研究，ΔNp63基因表達的降低明顯減弱了HeLa細胞的侵襲能力，其作用機制目前尚不明確，有待于進一步研究。本研究為ΔNp63基因在宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用提供了一定的實驗基礎(chǔ)。

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