鄒家瓊 楊國(guó)珍 敬 鵬 羅昭遜
1.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系,貴州 貴陽(yáng) 550004;2.川北醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系,四川 南充 637000;3.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院小兒外科,四川 南充 637000
ΔNp63是p63基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物之一,在結(jié)構(gòu)上與p53具有高度的相似性,屬于p53家族,主要表達(dá)于表皮、宮頸、泌尿系統(tǒng)等具有鱗狀上皮分化潛能的基底細(xì)胞和旁基底細(xì)胞。最新的研究報(bào)道[1-2],ΔNp63基因在上皮源性腫瘤中改變了腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移作用。ΔNp63在各不同組織學(xué)類型的子宮頸癌中高表達(dá),且與腫瘤的分級(jí)相關(guān)[3]。這提示ΔNp63在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到重要的作用。為研究ΔNp63基因在宮頸癌中遷移、侵襲的機(jī)制,本研究針對(duì)人ΔNp63基因設(shè)計(jì)并合成小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)干擾此基因的表達(dá),同時(shí)在體外進(jìn)行觀察ΔNp63基因?qū)eLa細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);pGeneSil-1質(zhì)粒購(gòu)于武漢晶賽公司;lipofectamineTM2000購(gòu)于Invitrogen公司;質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于Omega公司。RPMI-1640購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司;胎牛血清購(gòu)于TBD公司。小鼠抗人ΔNp63多克隆抗體、小鼠抗人GAPDH單克隆抗體及兔抗小鼠IgG-HRP二抗均購(gòu)于Santa Cruz公司。10×SDS-PAGE電泳緩沖液以及SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)于上海寶曼生物科技有限公司;PVDF膜購(gòu)于Millipore 公司;其他試劑如:DEPC、MTT、G418、DMSO 等均購(gòu)自Sigma公司。Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室購(gòu)自Corning公司。
1.2.1 siRNA的設(shè)計(jì)、合成和標(biāo)記 在GenBank查找人源ΔNp63基因序列,根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則,并參考文獻(xiàn)[4-5],設(shè)計(jì)針對(duì)ΔNp63基因靶點(diǎn)的特異性寡核若酸序列,其序列為:AATGCCCAGACTCAATTTAGT;陰性對(duì)照siRNA是沒(méi)有靶基因的無(wú)關(guān)對(duì)照小RNA。GFP標(biāo)記的siRNA和陰性對(duì)照siRNA。以上序列均由武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司合成。
1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分組 HeLa細(xì)胞在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),規(guī)范換液傳代。轉(zhuǎn)染前利用胰酶消化收集細(xì)胞,將細(xì)胞按1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到50%~70%時(shí),采用lipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒,在轉(zhuǎn)染24 h后通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察HeLa細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后,將細(xì)胞分為4組:空白對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞),空載體組(只轉(zhuǎn)脂質(zhì)體的HeLa細(xì)胞),陰性質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染siRNA陰性對(duì)照的HeLa細(xì)胞),干擾質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染有陽(yáng)性轉(zhuǎn)染率的siRNA的HeLa細(xì)胞)。
1.2.3 Real-time PCR檢測(cè)ΔNp63 mRNA的表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞再培養(yǎng)48 h,利用胰酶消化收集細(xì)胞,按RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)中步驟提取各轉(zhuǎn)染組HeLa細(xì)胞的總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)ΔNp63的mRNA表達(dá)水平。根據(jù)ΔNp63的cDNA序列設(shè)計(jì)引物,其上游引物為:5'-TGCGCAGACTCAATTTAGTGAG-3',下游引物:5'-TCTGGATGGCGCATGTCTTTGC-3'。以 β-actin 作為內(nèi)參,依據(jù)β-actin的cDNA序列設(shè)計(jì)引物,其上游引物為:5'-TGACGTGGACATCCGCTAAG-3', 下游引物:5'-CTGGAAGGTGGACAGCCAGG-3'。以上引物皆由武漢晶賽生物工程 技術(shù)有限公司合成。 反應(yīng)條件:94℃ 4 min;94℃ 20 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,循環(huán)35次,72℃檢測(cè)信號(hào)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ΔNp63的相對(duì)值。
1.2.4 Western blot檢測(cè)ΔNp63的蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞再培養(yǎng)48 h,利用胰酶消化收集細(xì)胞,用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白,蛋白樣本經(jīng)變性后,10%SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,在室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h,分別加1∶200小鼠抗人ΔNp63抗體和1∶3 000小鼠抗人GAPDH單克隆抗體,4℃孵育12 h。12 h后TBST漂洗,加1∶5 000兔抗小鼠IgG-HRP二抗,室溫下孵育3 h,采用化學(xué)法曝光、顯影。分析條帶灰度值。
1.2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 采用強(qiáng)廷會(huì)等[6]的方法;預(yù)先用30 μg/mL 的 Matrigel膠 50 μL 處理 Transwell小室。 HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后,常規(guī)消化收集細(xì)胞。然后在侵襲小室的上部分別加入各組細(xì)胞100 μL(105),在侵襲小室的下部加入800 μL的10%FBS液,在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵化24 h。取出Transwell小室,去除小室上表面的細(xì)胞,4%多聚甲醛固定小室下表面的細(xì)胞20 min,用臺(tái)盼藍(lán)染色。光鏡下記數(shù)穿過(guò)小室的HeLa細(xì)胞數(shù),每組細(xì)胞各取5個(gè)視野計(jì)算其平均值。
1.2.6 同質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn) 將HeLa細(xì)胞接種于48孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)至融合為單層細(xì)胞;棄培養(yǎng)液,37℃預(yù)熱RPMI640,PBS沖洗去除懸浮細(xì)胞;RPMI640培養(yǎng)液重懸各組細(xì)胞至濃度為1×105個(gè)/mL,48孔板每孔加入 200 μL 重懸液,37℃培養(yǎng) 120 min,吸出培養(yǎng)液,用PBS洗細(xì)胞2次后計(jì)數(shù)未黏附細(xì)胞,每組重復(fù)4次;同質(zhì)黏附細(xì)胞數(shù)=加入的細(xì)胞數(shù)-未黏附細(xì)胞數(shù)。
1.2.7 異質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn) 依照Barbieri CE的細(xì)胞黏附性實(shí)驗(yàn)方法,將轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后的HeLa細(xì)胞1×105個(gè)/mL加入預(yù)先鋪上Ⅳ膠原的96孔板中,在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后,PBS清洗并吸除未黏附的細(xì)胞,滴加濃度為5 mg/mL的 MTT 20 μL,室溫下孵育 20 min,吸出 MTT 并滴入 200 μL的DMSO,用Bio-Rad酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定其在590 nm處測(cè)吸光度A值,每組重復(fù)檢測(cè)6次計(jì)算其平均值。
應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組間的比較采用方差分析,兩兩比較采用snk檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
采用RT-PCR法測(cè)定ΔNp63 mRNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示:在內(nèi)參β-actin表達(dá)一致的條件下,陰性質(zhì)粒組與空載體組細(xì)胞ΔNp63的mRNA表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而干擾質(zhì)粒組細(xì)胞中ΔNp63 mRNA的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。
表1 siRNA-ΔNp63對(duì)HeLa細(xì)胞ΔNp63 mRNA表達(dá)水平的影響()
表1 siRNA-ΔNp63對(duì)HeLa細(xì)胞ΔNp63 mRNA表達(dá)水平的影響()
注:Ct值為每個(gè)PCR反應(yīng)管中熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定域值時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)數(shù);與其他組比較,aP<0.05,bP<0.05,cP<0.05
組別 β-actin平均Ct值 ΔNp63平均Ct值 ΔNp63相對(duì)值正常細(xì)胞組空載體組陰性質(zhì)粒組干擾質(zhì)粒組20.344±0.318 21.255±0.192 20.532±0.303 20.653±0.314 23.568±0.259 22.577±0.161 22.512±0.258 23.422±0.315 0.438±0.012a 0.411±0.008b 0.263±0.010c 0.155±0.006*
Western-blot分析顯示,干擾質(zhì)粒組細(xì)胞ΔNp63蛋白表達(dá)量(0.243±0.021)明顯低于空白對(duì)照組(0.891±0.002)(P<0.05), 而空載體組 (0.878±0.011) 和陰性質(zhì)粒組 (0.746±0.003)與空白對(duì)照組細(xì)胞(0.891±0.002)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見(jiàn)圖 1。
圖1 siRNA-ΔNp63對(duì)HeLa細(xì)胞的ΔNp63蛋白表達(dá)水平的影響
四組細(xì)胞穿膜的細(xì)胞數(shù)分別為 (25.4±1.2)、(26.5±1.5)、(24.3±1.2)、(10.3±1.7)個(gè)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,空白對(duì)照組、空載體組和陰性質(zhì)粒組三組之間的細(xì)胞穿膜數(shù)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而干擾質(zhì)粒組穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠濾膜的細(xì)胞數(shù)較其余三組明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)圖2。
圖2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果
陰性質(zhì)粒組與空白對(duì)照組比較,二者同質(zhì)黏附細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異,而siRNA-ΔNp63干擾質(zhì)粒組分別與空白對(duì)照組和陰性質(zhì)粒組比較,同質(zhì)黏附細(xì)胞數(shù)明顯增加。見(jiàn)表2。
表2 ΔNp63干擾質(zhì)粒對(duì)HeLa細(xì)胞同質(zhì)黏附的影響
細(xì)胞異質(zhì)黏附性實(shí)驗(yàn)提示,siRNA-ΔNp63組細(xì)胞的異質(zhì)黏附性與空白對(duì)照組、空載體和陰性質(zhì)粒組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而空載體和陰性質(zhì)粒組細(xì)胞的異質(zhì)黏附性與空白對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。
p63基因是Yang等[7]在1998年發(fā)現(xiàn)的與p53同源的基因,由于轉(zhuǎn)錄起始的不同而分為TAp63和ΔNp63兩個(gè)亞型。ΔNp63在腫瘤中起癌基因作用[8-9]。近期研究表明,ΔNp63基因通過(guò)對(duì)侵襲、轉(zhuǎn)移進(jìn)行調(diào)節(jié)而影響腫瘤的發(fā)展[1,10-11]。
本研究采用脂質(zhì)體法將siRNA-ΔNp63干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中。然后通過(guò)RT-PCR和Western-blot測(cè)定ΔNp63的表達(dá),結(jié)果顯示siRNA-ΔNp63干擾質(zhì)粒明顯降低HeLa細(xì)胞中ΔNp63的表達(dá),這一結(jié)果表明siRNA-ΔNp63質(zhì)粒成功抑制HeLa細(xì)胞中ΔNp63基因的表達(dá)。
侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤特征性的生物學(xué)行為,也是致患者死亡的主要原因。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制復(fù)雜,包括腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附、降解基底膜和穿透基底膜是腫瘤細(xì)胞侵襲的三個(gè)重要環(huán)節(jié)[12]。因此,基底膜是阻止癌細(xì)胞侵襲、遷移的天然屏障。測(cè)定細(xì)胞穿透基底膜的能力可評(píng)估其侵襲能力。在本研究中,筆者通過(guò)MTT法檢測(cè)在590 nm處的吸光度來(lái)反映腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)黏附性同時(shí)采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞間的同質(zhì)黏附性,結(jié)果提示siRNA-ΔNp63干擾質(zhì)粒明顯減弱HeLa細(xì)胞遷移能力。同時(shí),通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)siRNA-ΔNp63干擾質(zhì)粒對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲能力的改變,結(jié)果顯示,穩(wěn)定表達(dá)siRNA-ΔNp63干擾質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞在體外與陰性質(zhì)粒組和空載體組比較,穿透侵襲能力明顯減弱。
圖3 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞的平均吸光度值
通過(guò)本課題組的研究,ΔNp63基因表達(dá)的降低明顯減弱了HeLa細(xì)胞的侵襲能力,其作用機(jī)制目前尚不明確,有待于進(jìn)一步研究。本研究為ΔNp63基因在宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[1]Fukushima H,Koga F,Kawakami S,et al.Loss of DeltaNp63alpha promotes invasion of urothelial carcinomas via N-cadherin/Src homology and collagen/extracellular signal-regulated kinase pathway [J].Cancer Res,2009,69(24):9263-9270.
[2]敬鵬,吳小候,羅春麗,等.ΔNp63基因?qū)CCB 5637細(xì)胞侵襲作用的影響[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,36(4):426-429.
[3]Westfall MD,Pietenpol JA.P63:molecular complexity in development and cancer[J].Carcinogenesis,2004,25(6):857-864.
[4]何云峰,吳小侯,羅春麗,等.△Np63 shRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及在膀胱癌中的作用[J].中華腫瘤雜志,2006,28(11):820-825.
[5]Barbieri CE,Tang LJ,Brown KA,et al.Loss of p63 leads to increased cell migration and up-regulation of genes involved in invasion and metastasis[J].Cancer Res,2006,66(15):7589-7597.
[6]強(qiáng)廷會(huì),王栓科,夏亞一,等.塞來(lái)昔布對(duì)骨肉瘤MG263細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響[J].腫瘤防治研究,2010,37(10):1136-1139.
[7]Yang A,Kaghad M,Wang Y,et al.p63 homolog at 3q27-29,encodes multiple with transactivating,death-inducing,and dominant-negative activities[J].Mol Cell,1998,2(3):305-316.
[8]He YF,Wu XH,Tang W,et al.Impaired Delta Np63 Expression is Associated with Poor Tumor Development in Transitional Cell Carcinoma of the Bladder[J].J Korean Med,2008,23(5):825-832.
[9]Cho MS,Chan IL,F(xiàn)lores ER.ΔNp63 transcriptionally regulates brachyury,a gene with diverse roles in limb development,tumorigenesis and metastasis[J].Cell Cycle,2010,9(12):2434-2441.
[10]Higashikawa K,Yoneda S,Tobiume K,et al.Snail-induced down-regulation of Delta Np63 alpha acquires invasive phenotype of human squamous cell carcinoma[J].Cancer Res,2007,67(19): 9207-9213.
[11]Yang X,Lu H,Yan B,et al.{Delta}Np63 versatilely regulates a broad NF-{kappa}B gene program and promotes squamous epithelial proliferation,migration,and inflammation[J].Cancer Res,2011,71(10):3688-3700.
[12]Liotta LA,Kohn EC.The microenvironment of the tumour-host interface[J].Nature,2001,411(6835):375-379.