馮榮潔 吳 鐵

廣東醫(yī)學(xué)院藥理教研室，廣東 湛江 524023

紅曲是紅曲霉菌（monascus purpureus）經(jīng)液體深層發(fā)酵精致而成的一種純天然、有益于人體健康的食品添加劑，也被稱為天然他汀，是降血脂的天然保健品，洛伐他汀被認(rèn)為是其主要的藥效成分。近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，洛伐他汀對(duì)乳腺癌有明顯地抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[1-4]。但天然紅曲是否也有抗癌作用，至今未有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)觀察天然紅曲70%乙醇提取物（紅曲E-70）對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖影響，探討該成分是否有抑制乳腺癌的作用，同時(shí)，與洛伐它汀進(jìn)行比較，了解紅曲的其他天然成分對(duì)洛伐他汀的抗癌作用是否有協(xié)同作用，為天然紅曲作為預(yù)防乳腺癌的保健食品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與癌細(xì)胞

①紅曲E-70：天然紅曲（東莞市天益生物工程有限公司提供）70%乙醇提取工藝為天然紅曲30 g，70%乙醇浸泡12 h，8倍量70%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，回收乙醇，減壓干燥后得70%乙醇提取物；②洛伐他?。褐袊?guó)藥品生物制品檢定所；③人乳腺癌細(xì)胞MCF-7：來自ATCC，10%FBS RPMI 1640培養(yǎng)，隔天換液，3～5 d傳代。

1.2 紅曲E-70水溶液中的洛伐他汀含量測(cè)定

1.2.1 供試液的制備 紅曲E-70 11.87 mg，用蒸餾水溶解定容至5 mL，過濾后待用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)液的制備 精密稱取洛伐他汀對(duì)照品0.40 mg，甲醇溶解定容至5 mL，超聲；以此濃度用甲醇稀釋成以下濃度，并定容至 5 mL，使終濃度為 0.005、0.01、0.02、0.04 mg/mL，過濾后待用。

1.2.3 色譜條件 流動(dòng)相： 甲醇∶0.002%磷酸溶液 （75∶25）；流速：1 mL/min；色譜柱為 kromasil C-18；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.4 每毫升紅曲E-70提取液中洛伐他汀含量的計(jì)算 用標(biāo)準(zhǔn)曲線法求出紅曲E-70水溶液里洛伐他汀的含量。

1.3 癌細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)（MTT法）

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，以10%FBS RPMI 1640培養(yǎng)液制成5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，然后以每孔100 μL接種到96孔板上，在37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，然后換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，之后再更換培養(yǎng)液；紅曲E-70組加入不同濃度的紅曲E-70 100 μL，終濃度分別為： 1、10、50、100、150 μg/mL；洛伐他汀組加入洛伐他汀對(duì)照品，其加入量為換算后紅曲E-70中洛伐他汀含量的相同劑量，用無水乙醇溶解 （無水乙醇最大體積為0.0078%，本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明此體積含量對(duì)MCF-7的增殖無影響），即終濃度為 0.001、0.01、0.05、0.1、0.15 μg/mL；對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)液；空白對(duì)照組不加細(xì)胞，加入等體積的培養(yǎng)液，每一樣品均設(shè)4個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48及72 h后，吸棄原培養(yǎng)液，每孔以PBS洗1次，加入100 μL新的無血清培養(yǎng)基和10 μL MTT溶液（濃度為5 mg/mL），輕振培養(yǎng)板。放回培養(yǎng)箱內(nèi)再孵育4 h后，吸棄上清液，每孔中加二甲基亞砜100 μL，置于暗處振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度（OD值），測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm。存活率計(jì)算公式為：存活率（%）=[（實(shí)驗(yàn)組 OD值-空白對(duì)照組 OD值）/（對(duì)照組 OD值-空白對(duì)照組OD值）]×100%。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用方差分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅曲E-70中洛伐他汀含量測(cè)定結(jié)果

以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：在0.005～0.08 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程為 y=612 53x-4.049 3，R2=0.999 9（圖 1），紅曲E-70水溶液的峰面積為149.428 18，代入回歸方程后得其濃度為0.002 50 mg/mL。紅曲E-70的濃度為2.37 mg/mL，據(jù)此求出每1毫克紅曲E-70中含有洛伐他汀0.001 mg。由圖2可知，洛伐他汀的出峰時(shí)間在12 min左右，圖3在12 min左右也有洛伐他汀峰，證明紅曲E-70中含有洛伐他汀。

圖1 洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 洛伐他汀對(duì)照品HPLC

圖3 紅曲乙醇提取物HPLC

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察藥物對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用

倒置顯微鏡下觀察經(jīng)過不同處理組中的MCF-7細(xì)胞形態(tài)變化（圖4A～G）。對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，透明度大，折光性強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)呈多邊形且連成片；經(jīng)不同濃度紅曲E-70處理后的MCF-7，生長(zhǎng)狀況差，折光性弱，貼壁細(xì)胞皺縮，變圓，隨著功能紅曲乙醇提取物濃度的增加，皺縮，變圓的程度增加，有些甚至脫落，漂浮；而洛伐他汀只有0.15 μg/mL組有部分細(xì)胞皺縮，變圓。

圖4 倒置顯微鏡觀察MCF-7細(xì)胞形態(tài)（10×10）

2.3 紅曲E-70對(duì)MCF-7增殖率的影響

與對(duì)照組相比，紅曲E-70在1～150 μg/mL對(duì)MCF-7均有抑制作用，50～150 μg/mL對(duì)MCF-7的抑制作用尤其明顯（P<0.05或P<0.01）；而經(jīng)換算后加入相應(yīng)量的洛伐他汀組，其對(duì)MCF-7的抑制作用不明顯，與對(duì)照組相比，只有0.15 μg/mL濃度組對(duì)MCF-7的抑制作用有顯著差異（P<0.05）。見表1。

3 討論

3.1 紅曲E-70對(duì)人乳腺癌MCF-7的抑制作用

紅曲E-70在1～150 μg/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)MCF-7均有抑制作用，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），隨著濃度增大，其抑制作用更加明顯，尤其在50～150μg/mL濃度范圍內(nèi)（P<0.01）。細(xì)胞形態(tài)觀察也表明，隨著紅曲E-70濃度的增加，細(xì)胞皺縮、變圓的程度增加，甚至出現(xiàn)細(xì)胞脫落，漂浮。有研究報(bào)道，紅曲黃色素Ankaflavin對(duì)人肝癌細(xì)胞Hep G2和人肺癌細(xì)胞A549具有誘導(dǎo)凋亡作用[5]。也有學(xué)者報(bào)道，紅曲橙色素OR能有效地抑制人胃癌細(xì)胞AGS的增殖，與常用的腺癌臨床治療藥物紫杉醇相比，橙色素OR對(duì)人胃癌細(xì)胞株AGS生長(zhǎng)的抑制效果更為顯著，且對(duì)人正常胃上皮細(xì)胞（GES-1）的毒性作用較小[6]。丁紅梅[7]觀察到紅曲多糖對(duì)小鼠S180肉瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，且高劑量組免疫器官脾臟質(zhì)量顯著增加，表明紅曲多糖有抗腫瘤作用。但紅曲對(duì)人乳腺癌MCF-7的抑制作用至今沒有報(bào)道，筆者研究證明，紅曲E-70對(duì)乳腺癌細(xì)胞有明顯的抑制作用。這種作用可能與其含有豐富的紅曲橙色素、紅色素、黃色素、多糖等成分有關(guān)，具體抑制癌細(xì)胞增殖的成分，還有待進(jìn)一步深入研究。

表1 紅曲E-70及洛伐他汀對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響（，n=4）

表1 紅曲E-70及洛伐他汀對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響（，n=4）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別 濃度（μg/mL）培養(yǎng)時(shí)間24 h 48 h 72 h對(duì)照組紅曲E-70組1洛伐他汀組10 50 100 150 0.001 0.01 0.05 0.1 0.15 0.260±0.011 0.240±0.012*0.238±0.014*0.213±0.019**0.210±0.010**0.194±0.013**0.252±0.005 0.253±0.007 0.249±0.008 0.241±0.011 0.237±0.012*0.256±0.010 0.230±0.012*0.235±0.011*0.225±0.012**0.207±0.011**0.186±0.008**0.256±0.008 0.256±0.014 0.253±0.006 0.246±0.010 0.238±0.011*0.255±0.010 0.227±0.012*0.218±0.012**0.199±0.011**0.185±0.008**0.175±0.010**0.255±0.015 0.247±0.012 0.245±0.021 0.239±0.019 0.227±0.016*

3.2 紅曲E-70對(duì)人乳腺癌MCF-7的抑制作用優(yōu)于洛伐他汀

本實(shí)驗(yàn)顯示，紅曲E-70抑制MCF-7增殖（P<0.05或P<0.01）。通過高效液相檢測(cè)紅曲E-70中的洛伐他汀含量，經(jīng)換算后，紅曲E-70最小有效量中，1 mL含有洛伐他汀0.001 μg，即洛伐他汀含量是紅曲E-70的千分之一。將紅曲E-70中對(duì)應(yīng)量的洛伐他汀加入MCF-7中進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示，紅曲中同劑量的洛伐他汀對(duì)MCF-7的增殖抑制作用不明顯，只有0.15 μg/mL組與對(duì)照組有顯著性差異（P<0.05）。已經(jīng)有報(bào)道，紅曲中主要成分之一洛伐他汀有抗腫瘤作用[8]。研究者分別以 4、8、16 μmol/L洛伐他汀處理 MCF-7細(xì)胞24～72 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的時(shí)相分布及細(xì)胞凋亡率，硝基藍(lán)四氮唑（NBT）還原實(shí)驗(yàn)鑒定細(xì)胞分化；研究結(jié)果提示，洛伐他汀對(duì)MCF-7細(xì)胞的影響主要是抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞分化，而誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的作用不明顯，同時(shí)洛伐他汀還能將該細(xì)胞阻滯于G0/G1期，作用存在濃度-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系。上述研究最小有效量4 μmol/L是筆者實(shí)驗(yàn)中洛伐他汀最大劑量0.15 μg/mL的11倍左右，由此推測(cè)，紅曲E-70抑制MCF-7細(xì)胞增殖可能不是主要通過洛伐他汀起作用。 還有研究者以 5.93、20、40、80 μmol/mL洛伐他?。↙V）和 20、50、75、100、150、200、250、300 μg/mL 紅曲提取物（RYR）分別作用于HCT-116和 HT-29；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LV抑制HCT-116和 HT-29的細(xì)胞增殖（P<0.001）并誘導(dǎo)凋亡（P<0.05），RYR 抑制 HCT-116 和 HT-29 增殖（P<0.001），而且作用于HCT-116時(shí)能誘導(dǎo)凋亡（P<0.05）；在LV組加入甲羥戊酸（MV），改變其抑制HCT-116和 HT-29增殖的作用，而RYR組加入MV并沒有改變其抑制細(xì)胞增殖作用，而不含莫那可林K（MK）的紅曲提取物組也沒有改變LV介導(dǎo)的抑制細(xì)胞增殖作用[9]。以上結(jié)果提示，紅曲提取物的組成包括洛伐他汀、色素和影響其作用的多種成分，作用于癌細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路可能與純品洛伐他汀不同。在筆者實(shí)驗(yàn)中，洛伐他汀組的有效劑量0.15 μg/mL是5.93 μmol/L的7%，而紅曲E-70的最小有效劑量（1 μg/mL）是以上研究RYR最小有效量（20 μg/mL）的 1/20。 洛伐他汀在 0.001～0.150 μg/mL濃度范圍內(nèi)其抑制癌細(xì)胞增殖作用明顯沒有紅曲E-70（1～150 μg/mL）的作用好，與文獻(xiàn)報(bào)道相似，提示紅曲E-70和洛伐他汀抑制癌細(xì)胞增殖的信號(hào)通路不同。紅曲E-70里可能含有多種抗腫瘤活性物質(zhì)活性成分，有可能可以通過不同的信號(hào)通路抑制癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，但具體是哪些成分起抑制作用和相關(guān)信號(hào)通路抑制癌細(xì)胞增殖還有待進(jìn)一步研究。

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