張淑琴 郭利 王煒 武華

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130122

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）是黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus）的代表種，在分類上與豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）和邊界病毒（Border disease virus，BDV）同為一屬，抗原性有交叉性反應(yīng)。病毒可感染牛、羊、豬等多種家畜和野生反芻動(dòng)物，但以牛為主。受感染牛表現(xiàn)為發(fā)熱、白細(xì)胞減少、腹瀉、流產(chǎn)、黏膜糜爛潰瘍等急性感染癥狀及小牛先天持續(xù)性感染。1946年，Olafson等[1]首次在美國(guó)東北部地區(qū)發(fā)現(xiàn)并分離出BVDV。到目前為止，該病呈世界性分布，在大多數(shù)養(yǎng)牛國(guó)家都存在，給世界養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。在我國(guó)，李佑民等[3]于1983年首次從國(guó)外引進(jìn)牛的流產(chǎn)胎兒脾臟中分離并鑒定出BVDV，自此以來(lái)，我國(guó)新疆、內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅、青海、黑龍江、河南、河北、山東、遼寧、陜西、山西、廣西、四川、江蘇、安徽等20多個(gè)省市自治區(qū)均檢出此病，個(gè)別地區(qū)陽(yáng)性率在85%以上[4]。

由于沒(méi)有很好的免疫防護(hù)措施，本病呈上升趨勢(shì)，對(duì)牛群的肥育、產(chǎn)奶和繁殖影響極大，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重危害。疫苗接種是本病最主要的預(yù)防和控制措施，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所自2006年就開(kāi)始進(jìn)行BVDV發(fā)病機(jī)理及疫苗研究，并成功分離到BVDV攻擊用強(qiáng)毒株[5]，正在進(jìn)行牛病毒性腹瀉弱毒活疫苗的研究。本研究統(tǒng)計(jì)了進(jìn)行牛病毒性腹瀉活疫苗研究過(guò)程中使用的部分試驗(yàn)動(dòng)物，確定血清中和試驗(yàn)與攻毒試驗(yàn)評(píng)價(jià)牛病毒性腹瀉弱毒活疫苗的保護(hù)效力的平行關(guān)系，為牛病毒性腹瀉病毒疫苗評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1）病毒和細(xì)胞。BVDV-SM疫苗株、BVDV-JL攻擊用強(qiáng)毒株和MDBK細(xì)胞，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所人獸共患病研究室保存。

2）主要試劑和儀器。DMEM培養(yǎng)基和馬血清，購(gòu)自Hyclone公司；牛血清購(gòu)自濟(jì)南勁牛公司科技有限公司；血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀由SYSMIX公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1）試驗(yàn)動(dòng)物分組。試驗(yàn)共使用3月齡以上健康易感斷乳牛125頭，免疫組70頭牛，對(duì)照組55頭牛。免疫組為頸部肌肉注射BVDV-SM株弱毒活疫苗；對(duì)照組為BVDV抗體陰性牛，頸部肌肉接種MDBK細(xì)胞凍融物。在免疫后最短28d后促凝采血，微量血清中和試驗(yàn)檢測(cè)BVDV抗體效價(jià)。按中和抗體效價(jià)結(jié)果將所有試驗(yàn)動(dòng)物重新分組。第1組：1∶2＜SN≤1∶16，10 頭牛；第 2 組：1∶16＜SN≤1∶64，13 頭牛；第 3組：SN＞1∶128，47頭牛；第 4組為對(duì)照組，SN=1∶1，55頭牛。所有動(dòng)物用BVDV-JL強(qiáng)毒株鼻內(nèi)噴霧接種攻擊，攻擊劑量為6×107.0TCID50/mL，攻毒后每日測(cè)量體溫，觀察記錄臨床癥狀并采集鼻拭子進(jìn)行病毒分離，隔日采血用于病毒分離和白細(xì)胞計(jì)數(shù)，攻毒后14d結(jié)束（見(jiàn)表1）。

2）免疫接種及抗體檢測(cè)。制備的BVDV-SM弱毒活疫苗在冷凍條件下由實(shí)驗(yàn)室運(yùn)送到免疫現(xiàn)場(chǎng)，疫苗融解后頸部肌肉注射1mL/頭，所用的疫苗樣品立即低溫保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室測(cè)定病毒毒價(jià)，回滴后確定免疫劑量。動(dòng)物免疫后，每周采血分離血清，用于血清抗體檢測(cè)。并于28d后采血分離血清，檢測(cè)血清抗體效價(jià)。

3）攻毒。試驗(yàn)牛使用BVDV-JL強(qiáng)毒（效價(jià)為107.0TCID50/mL）攻擊，攻擊劑量為6mL/頭，鼻內(nèi)噴霧接種，3mL/鼻孔。動(dòng)物接種強(qiáng)毒后，同時(shí)每天觀察臨床癥狀，包括食欲、精神狀態(tài)等；每天測(cè)定體溫，表現(xiàn)。

4）病毒分離。動(dòng)物接種強(qiáng)毒后，每日采集鼻拭子，隔日采血分離白細(xì)胞，用于病毒分離測(cè)定；試驗(yàn)于病毒攻毒后14d結(jié)束。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體檢測(cè)結(jié)果

動(dòng)物免疫后，體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗BVDV中和抗體。抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，免疫后14d內(nèi)開(kāi)始產(chǎn)生抗體，通常28d后中和抗體效價(jià)介于210～211，抗體水平在2～3個(gè)月達(dá)到高峰，持續(xù)數(shù)周后緩慢下降，免疫12個(gè)月抗體水平仍在1∶724以上。

2.2 攻毒后臨床觀察結(jié)果

所有試驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)BVDV-JL強(qiáng)毒株經(jīng)鼻內(nèi)噴霧攻毒后，對(duì)照牛（抗體陰性）的體溫超過(guò)基礎(chǔ)體溫1℃的有78%（43/55），白細(xì)胞數(shù)值下降，一般出現(xiàn)在第6天和第8天，93%（51/55）的牛白細(xì)胞下降比例超過(guò)30%。白細(xì)胞和鼻拭子病毒分離率為85%（47/55）。第 1 組 1∶2＜SN≤1∶16，有 70%（7/10）的牛體溫超過(guò)基礎(chǔ)體溫1℃，80%（8/10）的牛白細(xì)胞下降比例超過(guò)30%，70%（7/10）的牛在白細(xì)胞和鼻拭子中分離到病毒；第2組：1∶16＜SN≤1∶64，有46%（6/13）的牛體溫超過(guò)基礎(chǔ)體溫 1℃，62%（8/13）的牛白細(xì)胞下降比例超過(guò)30%，23%（3/13）的牛在白細(xì)胞和鼻拭子中分離到病毒；第3組：SN＞1∶128，有 4%（2/47）的牛體溫超過(guò)基礎(chǔ)體溫 1℃，2%（1/47）的牛白細(xì)胞下降比例超過(guò)30%，沒(méi)有牛（0/47）在白細(xì)胞和鼻拭子中分離到病毒。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 動(dòng)物分組情況

表2 攻毒后體溫檢測(cè)及臨床觀察結(jié)果

3 討 論

弱毒疫苗是預(yù)防和控制BVD-MD的主要措施，第1株牛病毒性腹瀉弱毒疫苗研究始于1961年，是把致細(xì)胞病變型BVDV毒株Oregon C24V在原代牛腎細(xì)胞上連續(xù)傳代而被致弱[6]；1964年，弱毒疫苗開(kāi)始大批量生產(chǎn)[7]，其用于預(yù)防牛病毒性腹瀉已有約50a的歷史。弱毒活疫苗既可刺激機(jī)體的細(xì)胞免疫，又可刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫；動(dòng)物免疫后產(chǎn)生免疫速度快并且免疫期持久，無(wú)需重復(fù)免疫。到目前為止，國(guó)外批準(zhǔn)上市的抗BVDV的疫苗達(dá)數(shù)百種[8]。在集約化養(yǎng)牛業(yè)日益發(fā)達(dá)的今天，國(guó)外牛病毒性腹瀉疫苗成了養(yǎng)牛業(yè)必須使用的疫苗之一。我國(guó)目前尚無(wú)自主研發(fā)的牛病毒性腹瀉病毒活疫苗，此項(xiàng)研究可填補(bǔ)這一空白。本試驗(yàn)將攻毒保護(hù)結(jié)果與攻毒時(shí)抗體效價(jià)結(jié)果平行比較分析，結(jié)果顯示，當(dāng)BVDV抗體效價(jià)高于1∶128時(shí)，疫苗免疫可以對(duì)牛產(chǎn)生良好的保護(hù)效力，保護(hù)率在80%以上，牛病毒性腹瀉病毒活疫苗的抗體水平與保護(hù)效力之間存在一定的平行關(guān)系。進(jìn)行牛病毒性腹瀉病毒活疫苗效力試驗(yàn)必須使用本動(dòng)物，沒(méi)有其他可供選擇的試驗(yàn)系統(tǒng)。本研究采用血清學(xué)效力檢驗(yàn)與靶動(dòng)物免疫攻毒保護(hù)相關(guān)性的研究，探討一種更適于成品疫苗效力檢驗(yàn)的評(píng)估方法，節(jié)約試驗(yàn)成本，提高試驗(yàn)效率，為牛病毒性腹瀉病毒活疫苗的效力檢驗(yàn)研究提供依據(jù)。

[1]OLAFSON P，MACCALLUM A D，F(xiàn)OX F H.An apparently new transmissible disease of cattle[J].Cornell Vet，1946（36）：205-213.

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[3]李佑民，劉振潤(rùn)，武銀蓮.牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒株（長(zhǎng)春184）的分離和鑒定[J].中國(guó)人民解放軍獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1983，3（2）：113-121.

[4]張寧，秦建華.牛病毒性腹瀉-黏膜病的診斷與防治[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2008，27（2）：8-11.

[5]張淑琴，郭利，冷雪，等.牛病毒性腹瀉病毒BVDV-JL株的分離與鑒定[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，33（3）：181-184.

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