孫弘宇，于 濤，于 平

(中國石油大慶煉化公司，黑龍江 大慶 163411)

根據(jù)有關(guān)生物代謝途徑，由于烷烴在水中的溶解度很小，菌體如何攝取到足夠量的烷烴是影響菌體生物轉(zhuǎn)化烷烴生產(chǎn)壬二酸的關(guān)鍵。烷烴被菌體吸收后，菌體代謝烷烴的核心是α、β、ω氧化，要提高壬二酸的產(chǎn)量必須促進(jìn)α、ω氧化，抑制β氧化。作者在此研究了生物法生產(chǎn)壬二酸的過程中吐溫-80、乙酸鈉、丙烯酸、苯巴比妥等小分子效應(yīng)物對壬二酸產(chǎn)率的影響。

1 實驗

1.1 出發(fā)菌種

熱帶假絲酵母。

1.2 方法

1.2．1 吐溫-80對壬二酸產(chǎn)率的影響

在配制發(fā)酵培養(yǎng)基時，加入不同量的吐溫-80，發(fā)酵結(jié)束后補(bǔ)水至原體積，通過測定發(fā)酵液中壬二酸的含量來研究吐溫-80對壬二酸產(chǎn)率的影響。

1.2.2 乙酸鈉對壬二酸產(chǎn)率的影響

在配制發(fā)酵培養(yǎng)基時，加入不同量的乙酸鈉，發(fā)酵24 h，測定菌液OD值；繼續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后補(bǔ)水至原體積，通過測定發(fā)酵液中壬二酸的含量來研究乙酸鈉對壬二酸產(chǎn)率的影響。

1.2.3 丙烯酸對壬二酸產(chǎn)率的影響

將丙烯酸稀釋10倍，單獨(dú)滅菌。發(fā)酵24 h時，將不同量丙烯酸加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中；繼續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后補(bǔ)水至原體積，通過測定發(fā)酵液中壬二酸的含量來研究丙烯酸對壬二酸產(chǎn)率的影響。

1.2.4 苯巴比妥對壬二酸產(chǎn)率的影響

在配制發(fā)酵培養(yǎng)基時，加入不同量的苯巴比妥，發(fā)酵結(jié)束后補(bǔ)水至原體積，通過測定發(fā)酵液中壬二酸的含量來研究苯巴比妥對壬二酸產(chǎn)率的影響。以不加苯巴比妥、且種子培養(yǎng)時未加入烷烴為對照組。

分別在種子培養(yǎng)開始時、發(fā)酵開始時、發(fā)酵12 h后加入0.2%苯巴比妥，通過測定發(fā)酵液中壬二酸的含量來確定苯巴比妥的最佳加入時間。

2 結(jié)果與討論

2.1 吐溫-80對壬二酸產(chǎn)率的影響

熱帶假絲酵母轉(zhuǎn)化烷烴的第一步是將細(xì)胞外的烷烴轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)，這一步是利用菌株對烷烴的親和力和乳化能力來實現(xiàn)的。

本實驗通過加入乳化劑吐溫-80來考察菌體吸收烷烴的效果。吐溫-80對壬二酸產(chǎn)率的影響見圖1。

圖1 吐溫-80對壬二酸產(chǎn)率的影響

由圖1可以看出，加入0.05%的吐溫-80，壬二酸產(chǎn)率達(dá)到最高；隨著吐溫-80添加量的增大，反而不利于產(chǎn)酸，壬二酸產(chǎn)率下降。這可能是因為，吐溫-80是菌體代謝的中間產(chǎn)物，加入少量的吐溫-80，能促進(jìn)烷烴和水的乳化，有利于菌體攝取烷烴，故能提高壬二酸的產(chǎn)率；但吐溫-80添加量過多，抑制了作為中間產(chǎn)物的乳化劑的產(chǎn)生，導(dǎo)致菌體攝取烷烴量不足，反而不利于產(chǎn)酸。

2．2 乙酸鈉對壬二酸產(chǎn)率的影響

乙酸基團(tuán)與乙酰CoA有相似處，且可作為菌體的碳源，添加適量的乙酸鈉有利于壬二酸的積累。乙酸鈉對壬二酸生長和產(chǎn)率的影響見圖2。

圖2 乙酸鈉對壬二酸生長和產(chǎn)率的影響

由圖2可以看出，添加乙酸鈉不僅能夠促進(jìn)菌體的生長而且有利于壬二酸產(chǎn)率的提高，但乙酸鈉添加量超過1.5%后，壬二酸的產(chǎn)率反而下降。這說明，乙酸鈉促進(jìn)產(chǎn)酸是由于菌體量增加的緣故；當(dāng)乙酸鈉添加量超過1.5%后，由于高濃度的乙酸鈉對菌體α、ω氧化有抑制作用，且抑制作用大于菌體量的增加，所以壬二酸產(chǎn)率反而下降。

2．3 丙烯酸對壬二酸產(chǎn)率的影響

據(jù)報道[1]，丙烯酸能抑制脂肪酸的β氧化。丙烯酸對壬二酸產(chǎn)率的影響見圖3。

圖3 丙烯酸對壬二酸產(chǎn)率的影響

由圖3可以看出，將0.10%的丙烯酸加入到培養(yǎng)基中能使壬二酸產(chǎn)率提高20%左右。這可能是由于，丙烯酸的加入，有效地抑制了菌體的β氧化，從而降低菌體分解壬二酸的能力，有利于壬二酸的積累；但過高濃度的丙烯酸卻抑制菌體的生長，使菌體的α、ω氧化也受到抑制，反而降低了壬二酸的產(chǎn)率。

2．4 苯巴比妥對壬二酸產(chǎn)率的影響

據(jù)報道[2]，烷烴能誘導(dǎo)細(xì)胞色素 P450完整的酶系，且P450酶的誘導(dǎo)量與烷烴濃度呈正相關(guān)。同時有研究發(fā)現(xiàn)，苯巴比妥也能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞色素 P450酶的生成[3]。苯巴比妥對壬二酸產(chǎn)率的影響見圖4。

圖4 苯巴比妥對壬二酸產(chǎn)率的影響

由圖4a可以看出，加入苯巴比妥與加入烷烴的產(chǎn)率相近，說明苯巴比妥與烷烴一樣能誘導(dǎo)細(xì)胞色素 P450酶的生成。當(dāng)苯巴比妥的添加量為0.1%～0.3%時，壬二酸的產(chǎn)率較高(圖4b)。

雖然加入的烷烴可以進(jìn)一步被微生物轉(zhuǎn)化為壬二酸，并對發(fā)酵液中提取精制純品影響小，但從成本上考慮，苯巴比妥的最適添加量為0.2%(25 g苯巴比妥價格不超過10.0元)，而烷烴的最適添加量為5%，成本較高。因此，選擇加入0.2%的苯巴比妥。

在不同時刻加入0.2%苯巴比妥的壬二酸產(chǎn)率見圖5。

圖5 苯巴比妥加入時刻對壬二酸產(chǎn)率的影響

由圖5可以看出，在發(fā)酵開始時加入苯巴比妥，壬二酸的產(chǎn)率最高(達(dá)61.1 g·L-1)，說明此時的誘導(dǎo)效果最好。因此，選擇發(fā)酵開始時加入苯巴比妥。

3 結(jié)論

發(fā)酵過程中小分子效應(yīng)物對壬二酸產(chǎn)率的影響較大：添加少量吐溫-80有利于菌體吸收和轉(zhuǎn)化烷烴；乙酸鈉、丙烯酸均能抑制菌體的β氧化；苯巴比妥與烷烴一樣能誘導(dǎo)P450酶的產(chǎn)生，明顯有利于壬二酸的生物轉(zhuǎn)化，在發(fā)酵開始時添加0.2%的苯巴比妥效果最好，壬二酸的產(chǎn)率可達(dá)61.1 g·L-1。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉樹臣，李蘭，方向晨.十三碳二元羧酸發(fā)酵技術(shù)的研究[J].微生物學(xué)報，2000，40(3)：318-322.

[2] 譚余慶，霍海如.苯巴比妥鈉誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450對內(nèi)毒素所致鼠毒性的保護(hù)作用[J].中國藥學(xué)雜志，2001，36(2)：97-100.

[3] 焦鵬，華玉濤，李書良，等.熱帶假絲酵母轉(zhuǎn)化烷烴過程中P450酶活的研究[J].微生物學(xué)報，2001，41(1)：117-120.