王晨波

(雀巢研發(fā)中心上海有限公司，上海 200080)

芽孢桿菌是一種常見的導(dǎo)致食源性疾病的菌種[1]，當生存條件惡劣時，它們能以孢子的形態(tài)繼續(xù)存活，因而一般的食品清潔加工手段很難將其完全清除，尤其是蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)[2]。

芽孢桿菌能夠在食物中產(chǎn)生嘔吐毒素(Cereulide)，該毒素非常穩(wěn)定，對于酸、堿(pH值2～11穩(wěn)定)和熱(121 ℃，30 min穩(wěn)定)都具有極高的耐受性。當人體感染了大量的芽孢桿菌時，它們會在小腸內(nèi)產(chǎn)生腸毒素從而導(dǎo)致人體發(fā)生嘔吐和腹瀉的癥狀[3～5]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，引起食物中毒的事件中，芽孢桿菌的數(shù)量均達到了106～109CFU·mL-1，因此,控制芽孢桿菌的生長繁殖是避免食物中毒的關(guān)鍵[6]。

雖然已經(jīng)有不少文獻就芽孢桿菌的特性及其生存條件作出了指導(dǎo)性的界定[7]，但均集中在對蠟樣芽孢桿菌特性的了解、分析和應(yīng)用上，很少涉及其它芽孢桿菌的菌種。而真正應(yīng)用于食品安全分析的菌種卻是毒性相對較小的菌種，如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和短小芽孢桿菌(Bacilluspumilis)等。因此，作者選取了14株常見芽孢桿菌，在此對其生存條件進行具體分析，擬為進一步的應(yīng)用實驗提供指導(dǎo)。

1 實驗

1.1 菌株

14株芽孢桿菌：2株Bacilluscirculans(BC1，BC2)，2株Bacillusmegaterium(BM1，BM2)，2株Bacillussubtilis(BS1，BS2)，1株Bacilluscereus(BAC01)，3株Bacilluspumilis(BPU1,BPU2，BPU3),1株Brevibacillusbrevis(BBB1)，1株Bacilluscoagulans(BCO1)，1株Bacilluslichenformis(BLI1)和1株Bacilluspolymyxa(BPO1)。BC1、BM1和BPU1購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，其余均由Juan L.Silva(Mississippi State University，MS，USA)博士提供。

1.2 細菌細胞的處理

所有的菌株都在腦心浸出液肉湯(BHI Broth，Difco)中于30 ℃、有氧條件下復(fù)活復(fù)壯[8]。實驗前均須經(jīng)過24 h的培養(yǎng)，然后在離心機(Sorvall?Biofuge Fresco)1000×g轉(zhuǎn)速(4 ℃，2 min)下用0.85%的鹽水清洗2次。分別在培養(yǎng)0 d、第1 d、第3 d、第7 d和第14 d取樣，使用Tryptic Soy Agar(TSA，Becton Dickinson)平板記錄芽孢桿菌的活菌數(shù)(CFU·mL-1)。

1.3 低水分活度環(huán)境對芽孢桿菌抑制作用的研究

將14株芽孢桿菌用0.85%鹽水離心(1000×g，4 ℃，2 min)清洗2次，然后各取10 μL分別接入5種不同水分活度(AW，0.86、0.87、0.89、0.92、0.94；由固體氯化鈉和甘油調(diào)節(jié)AW)[9]的10 mL BHI培養(yǎng)基中，在0 d、第1 d、第3 d、第7 d和第14 d取樣觀察芽孢桿菌的生長情況。

1.4 低pH值環(huán)境對“酸適應(yīng)”芽孢桿菌抑制作用的研究

將14株芽孢桿菌接入10 mL BHI培養(yǎng)基(由1 mol·L-1鹽酸調(diào)pH值至5.0)中，在30 ℃、有氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h，即得“酸適應(yīng)”芽孢桿菌。將“酸適應(yīng)”芽孢桿菌用0.85%鹽水離心(1000×g，4 ℃，2 min)清洗2次，然后各取10 μL分別接入5種不同pH值(3.4、3.8、4.0、4.4、4.6；由1 mol·L-1鹽酸調(diào)pH值)[10]的10 mL BHI培養(yǎng)基中，在0 d、第1 d、第3 d、第7 d和第14 d取樣觀察芽孢桿菌的生長情況。

1.5 檸檬酸對“適應(yīng)”芽孢桿菌抑制作用的研究

將14株芽孢桿菌接入10 mL BHI培養(yǎng)基(由1 mol·L-1檸檬酸調(diào)pH值至5.0)中，在30 ℃、有氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h，即得“適應(yīng)”芽孢桿菌。將“適應(yīng)”芽孢桿菌用0.85%鹽水離心(1000×g，4 ℃，2 min)清洗2次，然后各取10 μL分別接入5種不同pH值(3.4、3.8、4.0、4.4、4.6；由1 mol·L-1檸檬酸調(diào)pH值)的10 mL BHI培養(yǎng)基中，在0 d、第1 d、第3 d、第7 d和第14 d取樣觀察芽孢桿菌的生長情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 低水分活度環(huán)境對芽孢桿菌的抑制作用(圖1)

a～e,AW:0.86,0.87,0.89,0.92,0.94

由圖1可看出，芽孢桿菌對于低水分活度環(huán)境的耐受性有限：AW在0.86時，所有的菌株都沒有生長，BC2和 BM2不能存活；AW在0.87時，BLI1、BC1和BPU1可以生長，BC2、BM2和BAC01不能存活；AW在0.89時，除了BPO1保持菌落數(shù)不變，BC2、BM2和BAC01的菌落數(shù)下降，其余菌株都能有不同速率的生長；AW在0.92時，除了BM2保持菌落數(shù)不變，BC2和BAC01的菌落數(shù)下降，其余菌株都能生長；AW在0.94時，所有菌株都能生長。

2.2 低pH值環(huán)境對“酸適應(yīng)”芽孢桿菌的抑制作用(圖2)

由圖2可看出，芽孢桿菌對于低pH值環(huán)境的耐受性有限：pH值<4.0時，所有的菌株都沒有生長，BC2、BAC01和 BBB1不能存活；pH值為4.4時，BS1、BBB1和BCO1可以生長，BC2和BAC01不能存活；pH值為4.6時，BS1、BS2、BBB1、BCO1、BC1、BM1、BPU1和BPO1可以生長，BC2和BAC01不能存活。

2.3 檸檬酸對“適應(yīng)”芽孢桿菌的抑制作用(圖3)

由圖3可看出，使用檸檬酸來調(diào)節(jié)pH值,加強了對芽孢桿菌的抑制效果，對Bacillusmegaterium的抑制效果尤其明顯：pH值<4.4時，所有的菌株都沒有生長，BM1、BM2和 BBB1不能存活；pH值為4.6時，BS2可以生長，BM1和BM2不能存活。

a～e,pH值：3.4，3.8，4.0，4.4，4.6

a～e,pH值：3.4，3.8，4.0，4.4，4.6

3 結(jié)論

將14株芽孢桿菌在不同水分活度和pH值條件下培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14株芽孢桿菌對低水分活度(<0.86)和低pH值(<4.4)的耐受性均有限，耐受性強弱(依次為)：

(1)對于水分活度(AW)：BLI1>BC1>BPU1>BM1>BS1，BS2，BPU2，BPU3，BBB1>BCO1>BPO1>BM2>BC2，BAC01。

(2)對于pH值：BS1，BCO1>BBB1>BS2，BC1，BM1，BPU1，BPO1>BM2，BPU2，BPU3，BLI1>BAC01，BC2。

(3)對于檸檬酸：BS2>BC1，BC2，BS1，BAC2，BPU1，BPU2，BPU3，BPO1，BCO1>BLI1>BBB1>BM1，BM2。

參考文獻：

[1] Lund B M，Baird-Parker T C，Gould G W.The Microbiological Sa-fety and Quality of Food[M].Aspen Publishers，2000:1029-1056.

[2] Grein T.Outbreak ofBacilluscereusfood poisoning[D].ID Bulletin，Department of Public Health，Dublin，Ireland，2001.

[3] Taylor J M W，Sutherland A D，Aidoo K E，et al.Heat-stable toxin production by strains ofBacilluscereus，Bacillusfirmus，Bacillusmegaterium，BacillussimplexandBacilluslicheniformis[J].FEMS Microbiology Letters，2005，242(2):313-317.

[4] Mahler H, Pasi A,Kramer J M，et al.Fulminant liver failure in association with the emetic toxin ofBacilluscereus[J].New England Journal of Medicine，1997,1336(16):1142-1148.

[5] Doyle M P，Beuchat L R.Food Microbiology：Fundamentals and Frontiers(2nd Ed)[M].ASM Press，2001：373-381.

[6] Salkinoja-Salonen M S，Vuorio R，Andersson M A，et al.Toxigenic strains ofBacilluslicheniformisrelated to food poisoning[J].Appl Environ Microbiol，1999，65(10)：4637-4645.

[7] Opinion of the scientific panel on biological hazards onBacilluscereusand otherBacillusspp.in foodstuffs[Z].The EFSA Journal，2005，175:1-48.

[8] Genigeorgis C,Martin S,Franti C E,et al.Initiation ofStaphylococcalgrowth in laboratory media[J].Appl Microbiol，1971,21(5):934-939.

[9] Raevuori M，Genigeorgis C.Effect of pH and sodium chloride on growth ofBacilluscereusin laboratory media and certain foods[J].Appl Microbiol，1975，29(1):68-73.

[10] Quintavalla S，Parolari G.Effects of temperature，AWand pH on the growth ofBacilluscells and spores：A response surface methodology study[J].Int J Food Microbiol，1993，19(3):207-216.