陳 歡，葉邦策

(華東理工大學 生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237)

天藍色鏈霉菌是研究鏈霉菌的模式菌，2002年完成測序工作，預測基因大約為7825個，調(diào)控基因占到12.3%[1]。σR(sigR)是天藍色鏈霉菌細胞內(nèi)氧化還原自穩(wěn)的廣域調(diào)控子，受σR調(diào)控的基因超過30個。trxBA和trxC是受σR調(diào)控的下游基因，編碼硫氧還原蛋白及二硫鍵還原途徑相關(guān)的酶基因。trxBA和trxC基因受到σR調(diào)控激活后開始大量轉(zhuǎn)錄表達，翻譯出硫氧還原蛋白和二硫鍵還原途徑的相關(guān)酶，這些酶快速地發(fā)揮它們的酶活性，以最快速度消除由于氧化壓力對細胞內(nèi)蛋白帶來的損傷，使天藍色鏈霉菌安全度過惡劣的氧化狀態(tài)，忍受極端的環(huán)境[2]。

RsrA蛋白是調(diào)控σR活性的anti-sigR因子，對天藍色鏈霉菌的σR調(diào)控機理的研究非常重要。

為深入研究RsrA蛋白的功能，作者在此將RsrA蛋白用青色熒光蛋白CFP進行標記融合表達[3，4]，通過構(gòu)建rsrA/cfp/pET-28a(+)融合表達質(zhì)粒，在大腸桿菌BL21(DE3)中大量表達；利用鎳柱親和層析分離純化RsrA-CFP蛋白，并用SDS-PAGE鑒定蛋白分子量和純度；利用圓二色性初步測定RsrA-CFP融合蛋白二級結(jié)構(gòu)，為RsrA蛋白的后續(xù)功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

天藍色鏈霉菌M145，上海交通大學鄧子新教授饋贈；大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21(DE3)、pET-28a(+)質(zhì)粒，生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室保藏；pECFP-N1質(zhì)粒，華東理工大學楊弋教授饋贈。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：稱取2.5 g LB粉末，加入去離子水，攪拌至全部溶解，定容到100 mL。若配制固體培養(yǎng)基，則另加入1.5%瓊脂。121 ℃滅菌30 min，冷卻備用。

YEME培養(yǎng)基：分別稱取3 g酵母提取物、5 g蛋白胨、3 g麥芽提取物、10 g葡萄糖，加入去離子水，攪拌至全部溶解，定容到1000 mL。115 ℃滅菌20 min，冷卻后添加2 mL 2.5 mol·L-1的MgCl2·6H2O(121 ℃滅菌30 min)。

1.1.3 試劑

限制性內(nèi)切酶EcoRI、HindⅢ、NcoI、DNA聚合酶rTaq、GC Buffer、Buffer、dNTP、T4連接酶、DNA ladder，Takara公司；LB粉末、瓊脂糖凝膠DNA回收純化(離心柱型)試劑盒、細菌基因組DNA抽提(離心柱型)試劑盒、PCR產(chǎn)物回收純化(離心柱型)試劑盒，上海捷瑞；瓊脂糖，上海博升；質(zhì)粒小提(離心柱型)試劑盒，天根生化。測序由上海美季生物公司完成，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1rsrA和cfp基因的克隆

將天藍色鏈霉菌M145接種至YEME培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)3～4 d，進行基因組抽提。根據(jù)CFP和RsrA蛋白融合特點進行引物設(shè)計：rsrA正向引物RsrAA:5′-CATGCCATGG-GCAGCTGCGGAGAGCCG-3′(NcoI)，rsrA反向引物RsrAB:5′-CCGGAATTCGGACTCCTGCGGGG-CCG-3′(EcoRI)，cfp正向引物CFPA:5′-CGGAATTCGGAGGAAGCATGGTGAGCAAGGGCGA-3′(EcoRI)，cfp反向引物CFPB:5′-CCCAAGCTTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′(HindⅢ)。除必要的酶切位點和保護堿基外，rsrA正向引物增加2 bp用于消除移碼突變，cfp正向引物增加9 bp的linker用于消除結(jié)構(gòu)域之間的相互影響。

rsrA基因擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸 7 min。rsrA基因擴增體系：ddH2O 15 μL，GC Buffer(×2) 25 μL，dNTP 4 μL，RsrAA(20 μmol·L-1) 2 μL，RsrAB(20 μmol·L-1) 2 μL，M145基因組2 μL，rTaq 0.3 μL，總體系50 μL。

cfp基因擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸 7 min。cfp基因擴增體系：ddH2O 35 μL，Buffer(×10) 5 μL，dNTP 4 μL，CFPA(20 μmol·L-1) 2 μL，CFPB(20 μmol·L-1)2 μL，質(zhì)粒pECFP-N1 2 μL，rTaq 0.3 μL，總體系50 μL。

1.2.2rsrA/pET-28a(+)表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將rsrA片段與質(zhì)粒pET-28a(+)分別進行NcoI和EcoRI雙酶切，酶切條件為37 ℃水浴3 h。雙酶切體系：Buffer K(×10) 5 μL，ddH2O 31 μL，BSA 5 μL，rsrA或pET-28a(+) 5 μL，EcoRI 2 μL，NcoI 2 μL，總體系50 μL。

將雙酶切后的rsrA與pET-28a(+) 在連接體系中按10∶1連接，連接條件為16 ℃水浴過夜。連接體系：Buffer(×10) 1 μL，ddH2O 7.0 μL，rsrA0.4 μL，pET-28a(+) 1.2 μL，T4連接酶0.4 μL，總體系10 μL。

將10 μL連接液全部轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌液PCR鑒定后將陽性克隆送測序。

1.2.3rsrA/cfp/pET-28a(+)融合表達質(zhì)粒的構(gòu)建

抽提上述重組質(zhì)粒rsrA/pET-28a(+)，將cfp片段與質(zhì)粒rsrA/pET-28a(+)進行EcoRI和HindⅢ雙酶切，酶切條件為37 ℃水浴3 h。雙酶切體系：Buffer M(×10) 5 μL，ddH2O 36 μL，cfp或rsrA/pET-28a(+) 5 μL，EcoRI 2 μL，HindⅢ 2 μL，總體系50 μL。

將雙酶切后的cfp與rsrA/pET-28a(+)在連接體系中按10∶1連接，連接條件為16 ℃水浴過夜。連接體系：Buffer(×10) 1 μL，ddH2O 6.9 μL，cfp0.4 μL，rsrA/pET-28a(+) 1.3 μL，T4連接酶0.4 μL，總體系10 μL。

將10 μL連接液全部轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α[5]，雙酶切篩選鑒定后將陽性克隆送測序，隨后將序列完全正確的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)。

1.2.4 RsrA-CFP蛋白的誘導表達及其條件優(yōu)化

1.2.4.1 RsrA-CFP蛋白誘導表達及熒光測定

對上述構(gòu)建的rsrA/cfp/pET-28a(+)/BL21(DE3)菌種進行37 ℃培養(yǎng)過夜活化，按1%接種量接種至20 mL含有卡那霉素抗性(50 μg·mL-1)的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，于30 ℃誘導表達10 h。然后于45 000 r·min-1離心20 min，棄上清收集菌體，加入10 mL PBS緩沖溶液懸浮菌體，進行熒光測定。酶標參數(shù)設(shè)定為熒光測定，激發(fā)光440 nm，掃譜記錄460～600 nm。以波長為橫坐標、相對熒光值為縱坐標，用GraphPad Prism軟件繪制熒光曲線。

1.2.4.2 最佳 IPTG濃度的確定

在上述實驗中，RsrA-CFP蛋白表達量較低，因此需要對其進行表達優(yōu)化。將菌種按1%接種量接種至20 mL含有卡那霉素抗性(50 μg·mL-1)的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)3 h左右，分別加入0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的100 mmol·L-1IPTG于30 ℃搖床誘導表達10 h。然后于45 000 r·min-1離心20 min，棄上清收集菌體，加入10 mL PBS緩沖溶液懸浮菌體，測定相對熒光值，確定最佳IPTG濃度。

1.2.4.3 最佳OD600的確定

將菌種按1%接種量接種至20 mL含有卡那霉素抗性(50 μg·mL-1)的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)至OD600值分別為0.5、0.6、0.8、1.0時，加入1.0% IPTG，于30 ℃搖床誘導表達10 h。然后于45 000 r·min-1離心20 min，棄上清收集菌體，加入10 mL PBS緩沖溶液懸浮菌體，測定相對熒光值，確定最佳OD600。

1.2.5 SDS-PAGE鑒定

采用上述最佳條件進行蛋白的誘導表達，菌體經(jīng)超聲破碎后，收集粗蛋白液。利用融合蛋白尾部的His標簽進行鎳柱純化，操作步驟參照說明書。隨后進行SDS-PAGE蛋白電泳鑒定其分子量和純度。

1.2.6 圓二色性測定RsrA-CFP融合蛋白結(jié)構(gòu)

用PBS(pH值8.0)緩沖溶液將鎳柱純化的RsrA-CFP透析過夜，將透析后的樣品稀釋至0.5 μmol·L-1。圓二色性儀器預備，以5 L·min-1的流速通入氮氣，測量波長設(shè)定為190～260 nm，帶寬0.25 nm，測量速度2.5 nm·s-1，測量池10 mm(0<吸光值<2)。在相同參數(shù)條件下，先測定空氣背景基線，再測定PBS緩沖溶液和RsrA-CFP-PBS樣品的CD值，結(jié)果用CDNN軟件進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 rsrA和cfp基因的克隆(圖1)

M1.2000 bp Marker M2.5000 bp Marker 1.rsrA基因擴增產(chǎn)物2,3.pET-28a(+)質(zhì)粒抽提物 4.cfp基因擴增產(chǎn)物

由圖1可看出，rsrA目的條帶大小為333 bp(圖1a)；cfp目的條帶大小為744 bp(圖1b)。兩者均與電泳圖上的實際位置相一致，而且PCR反應(yīng)的特異性很好，無雜帶，純化后可用于后續(xù)實驗。

2.2 rsrA/pET-28a(+)表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定(圖2)

M.2000 bp Marker 1～10.PCR產(chǎn)物

理論上rsrA/pET-28a(+)PCR后的條帶大小為333 bp。由圖2可看出，大部分克隆菌都擴增出大小正確的條帶，選擇2#去測序，結(jié)果序列正確，保存此菌液，用于后續(xù)實驗。

2.3 rsrA/cfp/pET-28a(+)融合表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定(圖3)

M.5000 bp Marker 1,2.pET-28a(+)質(zhì)粒抽提物3，4，5.挑取的單克隆菌液質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物

理論上雙酶切后的2條條帶大小分別為1100 bp和5000 bp左右。由圖3可看出，條帶大小均正確，可認為是陽性克隆，選擇3#去測序，結(jié)果序列正確，可用于后續(xù)實驗。

2.4 RsrA-CFP蛋白誘導表達及條件優(yōu)化

2.4.1 RsrA-CFP蛋白誘導表達及熒光測定

熒光值的高低可以認為是融合蛋白表達量的高低，因此，可省去用SDS-PAGE蛋白電泳分析蛋白誘導表達量的步驟。酶標儀測定時，先掃全譜，確定其最大發(fā)射峰，再確定其最大激發(fā)峰。RsrA-CFP蛋白的熒光測定曲線見圖4。

圖4 RsrA-CFP蛋白的熒光測定曲線

由圖4可看出，最大發(fā)射峰為478 nm，與文獻值相吻合。最大激發(fā)峰為440～458 nm，與文獻的CFP熒光特性相吻合，可以確定其表達了目標蛋白RsrA-CFP。

2.4.2 最佳IPTG濃度的確定

IPTG濃度對RsrA-CFP蛋白表達的影響見圖5。

圖5 IPTG濃度對RsrA-CFP蛋白表達的影響

由圖5可看出，隨著IPTG濃度的增大，478 nm處的相對熒光值先升高后降低，在1.0%時達到最高。因此，確定最佳IPTG濃度為1.0%。

2.4.3 最佳OD600的確定

OD600對RsrA-CFP蛋白表達的影響見圖6。

圖6 OD600對RsrA-CFP蛋白表達的影響

由圖6可看出，478 nm處的相對熒光值隨著OD600的升高而降低。考慮到OD600過低不利于蛋白表達，確定最佳OD600為0.5左右。

2.5 SDS-PAGE鑒定(圖7)

M.蛋白Marker 1.RsrA-CFP

理論上RsrA-CFP蛋白分子量為40 kD左右。由圖7可看出，條帶大小基本正確，純度較高，可用于后續(xù)實驗。

2.6 圓二色性測定RsrA-CFP融合蛋白結(jié)構(gòu)(圖8)

圖8 圓二色性測定RsrA-CFP蛋白二級結(jié)構(gòu)

由圖8可看出，RsrA-CFP蛋白二級結(jié)構(gòu)特征CD峰明顯。CDNN軟件分析后顯示，在蛋白二級結(jié)構(gòu)中，螺旋結(jié)構(gòu)占32.2%、平行結(jié)構(gòu)占8.0%、反向平行結(jié)構(gòu)占9.3%、β折疊占16.7%、無規(guī)則卷曲占34.4%。這說明構(gòu)建表達的融合蛋白RsrA-CFP得到了很好的折疊，預示著非常好的活性。

2.7 討論

(1)首次將RsrA與CFP進行融合表達，這是利用青色熒光蛋白CFP作為熒光標記具有的優(yōu)點，有益于簡化后續(xù)確定誘導條件時的檢測程序，較傳統(tǒng)SDS-PAGE蛋白電泳大幅縮短了檢測時間，并降低了成本。

(2)大腸桿菌能夠?qū)⑻焖{色鏈霉菌內(nèi)rsrA基因與cfp進行融合可溶表達，證明了這兩種原核生物之間的基因相容性。

(3)利用圓二色性初步測定RsrA-CFP蛋白的CD值，CDNN軟件分析得到二級結(jié)構(gòu)組成，螺旋結(jié)構(gòu)占了1/3左右，說明構(gòu)建表達的融合蛋白RsrA-CFP得到了很好的折疊，蛋白很成熟，為后續(xù)RsrA蛋白的進一步功能研究奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

以天藍色鏈霉菌M145基因組作模板，擴增σR(sigR)的anti-sigR因子基因rsrA，得到了333 bp基因；以質(zhì)粒pECFP-N1作模板，擴增青色熒光蛋白基因cfp，得到了744 bp基因。將兩個基因融合串聯(lián)，構(gòu)建rsrA/cfp/pET-28a(+)融合表達質(zhì)粒。利用熒光檢測技術(shù)，確定大腸桿菌BL21(DE3)在OD600為0.5時，用1 mmol·L-1IPTG進行誘導能大量表達融合蛋白RsrA-CFP。用鎳柱親和層析分離純化RsrA-CFP蛋白，并用SDS-PAGE鑒定其分子量為40 kD左右。利用圓二色性初步測定RsrA-CFP蛋白的CD值，經(jīng)CDNN軟件分析得到：螺旋結(jié)構(gòu)占32.2%、平行結(jié)構(gòu)占8.0%、反向平行結(jié)構(gòu)占9.3%、β折疊占16.7%、無規(guī)則卷曲占34.4%，為RsrA蛋白的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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