趙其宏，張 穎，梁?jiǎn)?，欒恒飛，葉 英，曾因明

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，安徽 蚌埠 233004;2.江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221002)

二氮嗪是美國(guó)60代初期合成的噻嗪類衍生物，早期臨床上用于治療高血壓危象。自Garlid等［1］1997年首次報(bào)道二氮嗪預(yù)處理通過(guò)開放心肌細(xì)胞線粒體ATP敏感性鉀通道產(chǎn)生與缺血預(yù)處理類似的心肌保護(hù)效應(yīng)以來(lái)，眾多研究顯示，二氮嗪預(yù)處理［2］和后處理［3］均是通過(guò)開放線粒體 ATP敏感性鉀通道而發(fā)揮心肌保護(hù)效應(yīng)的。但最近研究表明［4］，二氮嗪預(yù)處理減輕心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷的作用還與磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號(hào)通路有關(guān)。PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的生存通路，該通路于心肌I/R期間的急性激活參與多種藥物后處理的心肌保護(hù)作用［5－6］。但在二氮嗪后處理中，PI3K/Akt信號(hào)通路的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本文旨在研究PI3K/Akt信號(hào)通路在二氮嗪后處理心肌保護(hù)中的作用，為二氮嗪用于心肌保護(hù)提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 二氮嗪、wortmannin(Sigma);氯化三苯基四氮唑(tripheny tetrazolium chloride，TTC)(Amresco);兔抗磷酸化Akt(Ser473)多克隆抗體(Cell Signaling);兔抗Akt多克隆抗體(Bioworld);小鼠抗β-actin單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔lgG、堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠lgG(中杉金橋生物公司);TUNEL試劑盒(Roche)。

1.2 儀器 DH-150型小動(dòng)物呼吸機(jī)(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠，杭州)，BL-420s生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(泰盟科技有限公司，成都)，TE-312型微量注射泵(Terumo公司，日本)，Bx50F4型光學(xué)顯微鏡(Olympus公司，日本);COOLPIX S1型照相機(jī)(Nikon公司，日本)。

1.3 動(dòng)物與分組 60只清潔級(jí)成年♂SD大鼠(由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量250～300 g，隨機(jī)分為5組(n=12):假手術(shù)組(S組)、I/R組、二氮嗪后處理組(D組)、wortmannin組(W組)和二氮嗪后處理+wortmannin組(D+W組)。

1.4 方法 參照文獻(xiàn)［7－8］，稍作改進(jìn)建立動(dòng)物模型:腹腔注射10%水合氯醛(400 mg·kg－1)麻醉，肝素鈉(500 U·kg－1)抗凝，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，股靜脈穿刺后連接輸液泵，氣管插管，機(jī)械通氣(呼吸頻率:75次/min;潮氣量:6～8 ml;吸 ∶呼=1∶2)，胸骨左緣3～4肋間進(jìn)胸暴露心臟，在左心耳根部與肺動(dòng)脈圓錐間下方約2 mm處進(jìn)針、穿線(橫跨左冠狀動(dòng)脈前降支)，在線環(huán)內(nèi)放一小段硅膠管，穩(wěn)定20 min后結(jié)扎縫線30 min，剪斷線結(jié)進(jìn)行再灌注120 min。S組只穿縫線，不結(jié)扎，25 min后經(jīng)股靜脈輸入0.1%DMSO;其余各組均進(jìn)行30 min缺血和120 min再灌注。缺血25 min后，I/R組、D組、W組和D+W組分別經(jīng)股靜脈輸注0.1%DMSO、二氮嗪28 mg·kg－1·h－1、PI3K 抑制劑 wortmannin 60 μg·kg－1·h－1和二氮嗪 28 mg·kg－1·h－1，其中 D+W組于輸注二氮嗪前5 min靜脈輸注wortmannin 60 μg·kg－1·h－1，所有藥物均持續(xù)輸注 15 min;二氮嗪和wortmannin均用0.1%DMSO稀釋。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 心功能指標(biāo) 氣管插管機(jī)械通氣后，每組取8只大鼠，用動(dòng)脈夾阻斷右頸總動(dòng)脈血流并在其上剪一V字型破口，將充滿肝素水且一端連接BL-420s生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的PE-50導(dǎo)管逆行插管至左心室，連續(xù)監(jiān)測(cè)心率(HR)、左室發(fā)展壓(LVDP)和左室舒張末壓(LVEDP)。

1.5.2 心肌梗死面積比率 每組取6只大鼠，再灌注末取下心臟并置于－20℃冰箱中10 min，取出后沿垂直心臟縱軸方向從心尖到結(jié)扎線下方將其切成2～3 mm厚的薄片，共5片，然后置于1%TTC磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)中，37℃孵育15 min，4%中性甲醛固定過(guò)夜，梗死區(qū)心肌為灰白色;心肌梗死面積比率/%=所有切片梗死面積之和/(左心室面積+右心室面積)×100%。

1.5.3 心肌凋亡率 每組取3只大鼠，再灌注末迅速剪取左心室前壁心肌組織浸入4%中性甲醛中固定24 h，自動(dòng)脫水機(jī)脫水，石蠟包埋、切片，按TUNEL試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色，凋亡的細(xì)胞核被染成棕褐色，未凋亡的細(xì)胞核為深藍(lán)色。高倍鏡(×400)下每張切片隨機(jī)選取10個(gè)互不重疊視野計(jì)算凋亡率:凋亡率/%=(視野內(nèi)凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)/視野內(nèi)所有細(xì)胞個(gè)數(shù))×100%。

1.5.4 p-Akt與總 Akt表達(dá)情況 每組取3只大鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后迅速剪取左心室前壁心肌組織，立即放入－70℃冰箱中保存，標(biāo)本取齊后在冰上剪碎、勻漿、裂解，4℃ 12 000×g離心10 min，取上清，蛋白濃度配平、變性后放入－20℃冰箱中備用。取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分離后將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h。加入1∶1 000的小鼠抗β-actin單克隆抗體或兔抗p-Akt(Ser473)多克隆抗體或兔抗Akt多克隆抗體中，4℃孵育過(guò)夜。取出后漂洗，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，振蕩孵育2 h。漂洗后，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯色。條帶掃描后分析灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以±s表示。心功能指標(biāo)分析采用雙因素重復(fù)測(cè)量方差分析;其余數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 心功能指標(biāo) 各組缺血前心功能指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。再灌注120 min后，與S組相比，其余4組HR和LVDP降低而LVEDP增加(P＜0.01);與I/R組比，D組與D+W組LVDP增加(P＜0.01)，LVEDP降低(P＜0.05或0.01);與 D組比，D+W組LVDP降低(P＜0.05)。見(jiàn)Tab 1。

2.2 心肌梗死面積 除S組外，其余4組再灌注末均有明顯的心肌梗死發(fā)生。與I/R組相比，D組和D+W組心肌梗死面積明顯減小(P＜0.01或0.05);與D組比，D+W組心肌梗死面積增加(P＜0.05)。見(jiàn)Fig 1。

2.3 心肌細(xì)胞凋亡率 與S組相比，其余4組凋亡率增加(P＜0.01);與I/R組相比，D組與D+W組凋亡率降低(P＜0.01);與D組比，D+W組凋亡率增加(P＜0.05)。見(jiàn)Fig 2。

2.4 p-Akt的表達(dá)情況 D組p-Akt表達(dá)水平明顯高于其余4組(P＜0.01);I/R組、S組和D+W組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)Fig 3。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用的在體左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎術(shù)是國(guó)內(nèi)外常用的模型，具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。本研究結(jié)果表明，再灌注120 min后，除S組外，其余4組均發(fā)生明顯的心肌梗死，提示心臟I/R模型制備成功。心肌I/R損傷與其經(jīng)受缺血時(shí)間的長(zhǎng)短有關(guān)，本研究采用的缺血30 min、再灌注120 min能夠很好地誘導(dǎo)心肌I/R損傷［7］和心肌凋亡［8］。

Fig 1 Myocardial infarct size at 120 min reperfusion after 30 min ischemia in different groups(±s，n=6)

Tab 1Comparation of hemodynamic parameter among five groups(±s，n=8)

Tab 1Comparation of hemodynamic parameter among five groups(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs baseline;+P＜0.05，++P＜0.01 vs S;#P＜0.05，##P＜0.01 vs I/R;△P＜0.05 vs D

Variable Group Baseline 30 min ischemia 120 mi n reperfusion HR/beats·min－1 S 372±44 370±41 342±38＊＊I/R 366±42 301±29＊＊++ 256±31＊＊++D 379±48 316±44＊＊+ 300±51＊＊+#W 360±38 302±39＊＊++ 248±25＊＊++D+W 351±36 319±44＊＊+ 280±49＊＊++LVDP/kPa S 16.3 ±2.3 16.0 ±2.2 15.6 ±1.6*I/R 17.1 ±1.9 11.2 ±0.7＊＊++ 4.8 ±0.8＊＊++D 15.8 ±1.9 10.6 ±0.9＊＊++ 8.6 ±0.9＊＊++##W 16.5 ±2.3 11.3 ±1.0＊＊++ 4.5 ±0.3＊＊++D+W 16.0 ±1.6 10.8 ±0.8＊＊++ 6.7 ±0.6＊＊++##△LVEDP/kPa S 0.20 ±0.19 0.20 ±0.20 0.23 ±0.28 I/R 0.06 ±0.22 1.30 ±0.54＊＊++ 2.12 ±0.50＊＊++D 0.13 ±0.29 1.07 ±0.46＊＊++ 1.20 ±0.37＊＊##W 0.24 ±0.19 1.43 ±0.62＊＊++ 2.18 ±0.65＊＊++D+W 0.23 ±0.30 1.08 ±0.54＊＊++ 1.65 ±0.37＊＊++#

HR和LVDP均是反映左心室收縮功能的指標(biāo)，但LVDP更敏感;LVEDP則反映左心室的舒張功能。本實(shí)驗(yàn)顯示二氮嗪后處理能夠明顯改善心肌收縮和舒張功能，而PI3K抑制劑wortmannin則部分逆轉(zhuǎn)左心室收縮功能的改善。本研究還提示，wortmannin部分消除二氮嗪后處理減小大鼠在體I/R心肌的梗死面積，與 Matejíková 等［4］對(duì)二氮嗪預(yù)處理離體灌注大鼠心臟的研究結(jié)果相似。此外，二氮嗪后處理還明顯減少I/R誘導(dǎo)的心肌凋亡，wortmannin部分消除這一作用。進(jìn)一步Western blot分析p-Akt顯示，二氮嗪后處理引起p-Akt表達(dá)的增加;而wortmannin消除這一效應(yīng)。p-Akt表達(dá)水平的變化與心肌保護(hù)效應(yīng)變化的趨勢(shì)一致;但wortmannin完全抑制PI3K/Akt信號(hào)通路后，二氮嗪后處理的心肌保護(hù)效應(yīng)只是部分被消除，說(shuō)明尚有其他機(jī)制參與，本實(shí)驗(yàn)未作進(jìn)一步研究。

Fig 2 A:Apoptotic cells in rat hearts detected by TUNEL staining at 120 min reperfusion after 30 min ischemia in different groups(×400，bar=50μm);B:Apoptotic rate of myocardial cells at 120 min reperfusion after 30 min ischemia in different groups(±s，n=3)

本研究選擇的二氮嗪劑量為7 mg·kg－1，這一劑量已被證實(shí)對(duì)大鼠心肌具有良好的保護(hù)作用［2］。本實(shí)驗(yàn)選用的PI3K抑制劑為wortmannin，它與ATP催化位點(diǎn)共價(jià)結(jié)合而不引起電生理效應(yīng)［9］;因此，不影響心肌收縮和舒張功能。此外，本實(shí)驗(yàn)所用的wortmannin劑量能夠很好地阻斷缺血預(yù)處理［10］和缺血后處理［11］引起的Akt磷酸化。

Fig 3 A:Western blot Akt and p-Akt in myocardial tissue at 120 min reperfusion after 30 min ischemia;B:Graphic presentation of p-Akt in myocardial tissue at 120 min reperfusion after 30 min ischemia(±s，n=3)

綜上所述，本研究結(jié)果提示二氮嗪后處理部分通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路減輕大鼠在體心肌I/R損傷，但PI3K/Akt信號(hào)通路是通過(guò)何種機(jī)制被激活以及該通路活化后如何發(fā)揮心肌保護(hù)作用，還有待于進(jìn)一步研究。

［1］ Garlid K，Paucek P，Yaro-Yarovoy V，et al.Cardioprotective effect of diazoxide and its interaction with mitochondrial ATP-sensitive K+channels:possible mechanism of cardioprotection［J］.Circ Res，1997，81(6):1072 －82.

［2］ Ahmad N，Wang Y，Haider K H，et al.Cardiac protection by mitoKATP channels is dependent on Akt translocation from cytosol to mitochondria during late preconditioning［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，290(6):H 2402 －8.

［3］ 段忠心，劉興奎，喻 田.二氮嗪后處理對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的影響［J］.中華麻醉學(xué)雜志，2010，30(10):1163－7.

［3］ Duan Z X，Liu X K，Yu T.Effects of diazoxide postconditioning on myocardial ischemia-reperfusion injury in isolated rat hearts［J］.Chin J Anesthesiol，2010，30(10):1163 －7.

［4］ Matejíková J，Ravingerová T，Pancza D，et al.Mitochondrial KATP opening confers protection against lethal myocardial injury and ischaemia-induced arrhythmias in the rat heart via PI3K-Aktdependent and-independent mechanisms［J］.Can J Physiol Pharmacol，2009，87(12):1055 －62.

［5］ 于 水，楊?？郏?琰，等.PI3K/Akt信號(hào)通路在外源性硫化氫后處理大鼠離體心肌中的作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(6):421－6.

［5］ Yu S，Yang H K，Mi Y，et al.Function of PI3K/Akt signaling pathway in exogenous hydrogen sulfide postconditioning on isolated rat hearts［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(6):421 －6.

［6］ 張 珺，劉金東.七氟烷預(yù)處理對(duì)成年及幼年大鼠心肌缺血/再灌注損傷保護(hù)作用的對(duì)比研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(8):1116－20.

［6］ Zhang J，Liu J D.A contrast study on sevoflurane preconditioning against myocardial ischemia/reperfusion injury in adult and young rat hearts［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(8):1116 －20.

［7］ 張羽冠，宋宏宇，李 鎣，等.蒺藜皂甙預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(6):714－8.

［7］ Zhang Y G，Song H Y，Li Y，et al.［J］.Protective effects of GSTT preconditioning on myocardial ischemia-reperfusion injury in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(6):714 －8.

［8］ 姚玲玲，黃曉偉，朱依純.離體和在體大鼠心肌細(xì)胞凋亡模型的建立［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(6):879 －81.

［8］ Yao L L，Huang X W，Zhu Y C.Establishment of the in vitro and in vivo cardiomyocyte apoptosis model［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(6):879 －81.

［9］ Sun H，Oudit G Y，Ramirez R J，et al.The phosphoinositide 3-kinase inhibitor LY294002 enhances cardiac myocyte contractility via a direct inhibition of Ik，slow currents［J］.Cardiovasc Res，2004，62(3):509－20.

［10］ Mocanu M M，Bell R M，Yellon D M.PI3 kinase and not p42/p44 appears to be implicated in the protection conferred by ischemic preconditioning［J］.J Mol Cell Cardiol，2002，34(6):661 －8.

［11］ Manintveld O C，Te Lintel Hekkert M，van den Bos E J，et al.Cardiac effects of postconditioning depend critically on the duration of index ischemia［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，292(3):H 1551－60.