千 珂 王 榮 張偉東 唐志書 顧 宜 王曉娟

1.陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2.第四軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710032

元仁膠囊由元胡、酸棗仁等中藥組成，具有寧心安神、益肝養(yǎng)血的功效，用于心肝血虛引起的焦慮、失眠、抑郁癥狀。元胡主要的活性成分為延胡索乙素及其他生物堿，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠及安定作用。國內(nèi)外研究表明，延胡索乙素在高架十字迷宮模型上具有抗焦慮的作用，可能與GABA受體的苯二氮結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)。延胡索乙素能夠通過抑制杏仁體釋放多巴胺來抑制南印防己毒素誘導(dǎo)的大鼠自主運(yùn)動(dòng)（包括水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)以及運(yùn)動(dòng)距離）和旋轉(zhuǎn)次數(shù)增加，也能減少大鼠在冰水中的自主運(yùn)動(dòng)頻率。提高抗應(yīng)激能力。延胡索總堿除了有一定的鎮(zhèn)靜作用，還能提高小鼠的抗疲勞能力及耐缺氧能力，從而提高了機(jī)體的抗應(yīng)激能力[1-2]。對應(yīng)激狀態(tài)下心肌缺血壞死具有保護(hù)作用。制劑中的另一組分酸棗仁提取物或含其復(fù)方藥物具有抗抑郁抗焦慮、改善應(yīng)激的作用，影響焦慮大鼠行為學(xué)、血漿神經(jīng)肽Y和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)[3-4]。酸棗仁提取物組分復(fù)雜，各組分含量較低，因此對酸棗仁有效組分/指標(biāo)成分的選擇及測定都較為困難。延胡索乙素在制劑中含量高，因此采用高效液相色譜法對樣品中延胡索乙素進(jìn)行了質(zhì)量控制研究，經(jīng)考察方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

LC2010A HT高效液相色譜儀（日本島津）；BT125D十萬分之一電子分析天平（德國賽多利斯）；DL-180超聲儀（浙江省向山縣石蒲海天電子儀器廠）；Diamonsil C18分析柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；甲醇為色譜純；純凈水；其他試劑均為分析純。

酸棗仁皂苷A對照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號(hào)：110734-200510），延胡索乙素對照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號(hào)：110726-200610）；元仁膠囊（院內(nèi)自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別酸棗仁皂苷A

取本品內(nèi)容物1 g，加甲醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 mL溶解，作為供試品溶液。另取酸棗仁皂苷A對照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)與同一硅膠-G薄層板上，以水飽和的正丁醇為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，立即檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同顏色的斑點(diǎn)。薄層圖譜清晰，并且陰性無干擾。

2.2 含量測定

元胡主要含有效成分延胡索乙素，參照文獻(xiàn)含量測定方法[5]，采用高效液相色譜法測定本品中延胡索乙素的含量。

2.2.1 色譜條件 Diamonsil C18分析柱 （4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào) pH 值至 6.0）（55∶45）；柱溫：室溫；檢測波長：280 nm；流速：1.0 mL/min；理論板數(shù)按延胡索乙素峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。見圖1。陰性對照溶液在與延胡索乙素對照品色譜圖相同位置無干擾峰，表明樣品中其他成分對延胡索乙素的測定無干擾。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取延胡索乙素對照品適量，加50 mL甲醇制成每毫升含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 稱取樣品，約相當(dāng)于延胡索乙素5 mg，精密稱重，置50 mL量瓶中，加80%甲醇20 mL，超聲30 min，并用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，測定，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取處方量的除延胡索提取物以外的各組分，按元仁膠囊制備工藝制成陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對照溶液。

圖1 HPLC色譜圖

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取減壓干燥至恒重的延胡索乙素對照品5.02 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，作為對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液2、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表1。

以峰面積平均值（Y）對進(jìn)樣量（X）進(jìn)行回歸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=904386X+2997.2，r=0.9999。以峰面積對進(jìn)樣量作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。結(jié)果表明延胡索乙素在0.2～2.0 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度考察 取“2.2.2”項(xiàng)下同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次依測定法進(jìn)行測定，記錄延胡索乙素色譜峰面積，結(jié)果RSD為0.54%。

2.2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取樣品（批號(hào)：20080614）5份，分別精密稱取（約相當(dāng)于延胡索乙素5 mg），照本品含量測定方法進(jìn)行測定。見表2。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。

表1 延胡索乙素線性考察結(jié)果

表2 重復(fù)性考察結(jié)果

2.2.8 方法穩(wěn)定性考察 取同一對照品溶液，分別于0、2、4、8、12 h參照本品含量測定方法進(jìn)樣，測定延胡索乙素的峰面積，平均峰面積為902792，RSD為0.99%（n=5）。結(jié)果表明，本品溶液中延胡索乙素在12 h內(nèi)穩(wěn)定。見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已知含量的樣品 （批號(hào)：20080614）適量（約相當(dāng)于延胡索乙素2 mg）9份，分別精密加入減壓干燥至恒重的延胡索乙素對照品適量，使其含量分別為4、6、8 mg。照本品含量測定方法進(jìn)行測定，并計(jì)算回收率，結(jié)果顯示本方法準(zhǔn)確度良好。見表4。

2.2.10 樣品含量的測定 取樣品3批，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作，以“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，每批樣品測定3次取平均值，按外標(biāo)法計(jì)算每粒中延胡索乙素的含量。見表5。本品每粒含延胡索乙素（C21H25NO4）不少于25.0 mg。

3 討論

3.1 TLC展開劑

本實(shí)驗(yàn)中酸棗仁鑒別中所采用的TLC展開劑分別參見《中國藥典》2010年版酸棗仁及棗仁安神膠囊鑒別項(xiàng)下的相關(guān)條件[5]。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 三批樣品的含量測定結(jié)果（n=3）

3.2 供試品溶液制備方法的優(yōu)選

文獻(xiàn)收載的測定中成藥（丸劑、片劑或顆粒劑）中延胡索乙素時(shí)，采用的溶劑有含氨甲醇、6%醋酸和乙醚等[6-7]；提取方法常采用回流或超聲的方法。筆者在本研究中考察了不同溶劑、不同提取方法以及不同提取時(shí)間對延胡索乙素的提取情況，發(fā)現(xiàn)膠囊輔料和成藥中其他成分對延胡索乙素的提取有較大的影響。

3.2.1 提取溶劑的優(yōu)選 筆者考察了甲醇、80%甲醇和50%甲醇3種溶劑，經(jīng)超聲相同時(shí)間后，測定延胡索乙素峰面積，依次為1087342、1076452和875932，表明以甲醇或80%甲醇作為提取溶劑均較好，但甲醇提取溶劑較80%甲醇提取溶劑色譜圖中雜質(zhì)峰峰面積更大，因此選擇80%甲醇為提取溶劑。

3.2.2 提取方法的優(yōu)選 筆者曾以80%甲醇為溶劑，考察采用直接超聲提取法和水浴回流提取法對延胡索乙素的提取的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：加入80%甲醇后不論是加熱還是超聲都可以提取完全，峰面積基本相同。但超聲操作起來簡便，快速，因此選擇超聲提取。實(shí)驗(yàn)考察了超聲20、30、40、50 min的提取效果，結(jié)果表明延胡索乙素在30 min內(nèi)基本提取完全。

3.3 流動(dòng)相的優(yōu)選

有文獻(xiàn)報(bào)道測定延胡索乙素使用流動(dòng)相甲醇-水（70∶30）或甲醇-乙腈-0.1%氨水（磷酸調(diào)pH至9.0）[7-8]，前者峰形不對稱，后者pH較高，影響柱壽命。因此參照《中國藥典》2010年版一部“延胡索”項(xiàng)下所用流動(dòng)相為“甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào) pH 值至 6.0）（55∶45）”，并對水相和有機(jī)相的比例進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，考察其對樣品分離度的影響，結(jié)果在有機(jī)相從40%增加至70%，延胡索乙素可與相鄰峰分開。0.1%磷酸加入0.2%三乙胺調(diào)節(jié)pH值至6.0，pH值適中，三乙胺對延胡索乙素峰形有明顯改善作用。最終確定流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào) pH 值至 6.0）（55∶45）。

3.4 檢測波長的選擇

用二極管陣列紫外檢測器，在200～400 nm對延胡索乙素對照品峰進(jìn)行紫外掃描，測得延胡索乙素的最大紫外吸收波長為230、280 nm，230 nm檢測靈敏度較高，但干擾較大，參考《中國藥典》2010年版一部，確定測定波長為280 nm。筆者在本實(shí)驗(yàn)中根據(jù)元仁膠囊的特點(diǎn)，對供試品溶液的制備方法進(jìn)行了改進(jìn)，方法簡便易行，對其他中成藥的樣品處理有一定的借鑒作用。

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