李運(yùn)成 劉 婷 賀斌峰 王關(guān)嵩

S100A4，又被稱作Mts1，是S100蛋白家族的成員之一。研究發(fā)現(xiàn)S100至少包含25種蛋白，除了S100G以外，其他均為Ca2+結(jié)合蛋白。他們參與Ca2+信號傳導(dǎo)，并通過鈣離子信號傳導(dǎo)途徑作用于靶蛋白改變其活性，在細(xì)胞增殖、分化等過程中發(fā)揮重要作用。最近研究表明S100A4/Mts1基因不僅參與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，而且可促進(jìn)肺動脈平滑肌(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)的增殖、遷移，但其作用機(jī)制尚不明確［1-2］。本研究旨在對S100A4在低氧刺激肺動脈平滑肌增殖中的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

材料與方法

一、主要試劑

SD大鼠由重慶市動物實(shí)驗(yàn)中心提供，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、低糖DMEM培養(yǎng)基、胰酶均購自美國GIBCO公司;p-JAK2(#9134)兔抗鼠單克隆抗體、p-STAT3(#38167)兔抗鼠單克隆抗體購于美國Scien Cell公司;S100A4(#ab27957)兔抗鼠單克隆抗體購于Abcam公司;辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購自北京華肽先鋒生物公司(#40116);AG490購自武漢博士德公司;細(xì)胞裂解液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自PIERCE公司(#78503、#1856135);生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、DAPI購自江蘇碧云天科技有限公司(#A0277、#C1005)

二、方法

1.大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)細(xì)胞分離及培養(yǎng):PASMCs從雄性SD大鼠肺動脈中分離得到，方法參照文獻(xiàn)［3］。分離出的PASMCs在含10%的胎牛血清的低糖DMEM中于37℃、飽和濕度下5%CO2的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.大鼠PASMCs細(xì)胞的低氧刺激:取4瓶對數(shù)期生長、融合度95%以上的細(xì)胞，分為低氧組和干預(yù)組，吸出原有培養(yǎng)基，加入4 ml 0.1%FBS低糖DMEM培養(yǎng)基中常氧培養(yǎng)24 h，干預(yù)組在放入低氧環(huán)境前45 min加入30μM AG490(30μl)，低氧組加入等量生理鹽水，這兩組細(xì)胞放入在0.3%O2、5%CO2、94.7%N2低氧環(huán)境中分別培養(yǎng)0 h、8 h。

3.免疫熒光:用0.01M PBS洗滌各組細(xì)胞后，加入4%多聚甲醛覆蓋2～3 mim，室溫固定15 min，吸出固定液，PBS洗滌3次，每次5 min，冰凍10%甲醇覆蓋細(xì)胞3～5 mim，孵育10 min，冰凍PBS沖洗5 min，3%BSA(tritionin稀釋)封閉60 min，吸出封閉液，加入 S100A4兔抗鼠單克隆抗體(1︰50，購自Abcam)工作液，4℃過夜，PBS洗滌3次，每次5 min，室溫避光孵育2抗(生物素標(biāo)記的二抗為羊抗兔多克隆抗體，購自武漢博士德公司，工作濃度1︰200)1～2 h，PBS洗滌3次，每次5 min，加入 DAPI(1︰1000，購自碧云天)，避光封閉1 h，PBS洗滌3次，每次5 min，封片，使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行檢測。

四、Western blot檢測

1.S100A4蛋白的表達(dá)檢測:收集低氧組刺激0 h、8 h和低氧干預(yù)組細(xì)胞，加裂解液提取總蛋白，加5X Loading buffer，煮沸5 min變性。配制15%分離膠、5%濃縮膠后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，300 mA濕轉(zhuǎn)25 min，將PVDF膜置于5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用TBST洗膜10 min，加入5%脫脂奶粉稀釋的S100A4一抗(1︰1000)中4℃孵育過夜，次日TBST漂洗3次，每次5 min，放入5℅脫脂奶粉稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(1︰1000)抗體中室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，每次5 min，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。以GAPDH內(nèi)參蛋白進(jìn)行校正。

2.p-JAK2蛋白的表達(dá)檢測:收集干預(yù)組和對照組低氧刺激0 h、8 h的細(xì)胞，加裂解液提取總蛋白，加5X Loading buffer煮沸5 min變性。配制8%分離膠、5%濃縮膠后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，300 mA濕轉(zhuǎn)2.5 h。將PVDF膜置于5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用TBST洗膜10 min，加入5%BSA稀釋的p-JAK2一抗(1︰1000)中4℃孵育過夜，余步驟同前。

3.p-STAT3蛋白的表達(dá)檢測:收集各組的蛋白，變性后，配制10%分離膠、5%濃縮膠后進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳，300 mA濕轉(zhuǎn)1.5 h，將PVDF膜置于5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用TBST洗膜10 min，加入5%BSA稀釋的p-STAT3一抗(1︰1000)中4℃孵育過夜，余步驟同前。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Image-Pro Plus 10.0對圖像進(jìn)行分析，使用SPSS 13.0 for windows對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，兩組均數(shù)間比較用配對t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、免疫熒光

低氧0 h S100A4/Mtsl在胞漿中少量表達(dá)，低氧刺激8 h后胞漿及胞核中明顯表達(dá)，見圖1。

圖1 低氧刺激PASMCs 0 h及8 h組S100A4的表達(dá)

二、Western blot檢測

1.S100A4/Mtsl蛋白在低氧刺激8 h比低氧刺激0 h表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，AG490干預(yù)低氧刺激8 h組S100A4/Mtsl蛋白的表達(dá)較低氧刺激8 h組顯著下降(P＜0.05)，見圖2。

圖2 S100A4/Mtsl蛋白的表達(dá)

2.p-JAK2蛋白在低氧刺激8 h比低氧刺激0 h表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，AG490干預(yù)低氧刺激8 h組三種蛋白的表達(dá)較低氧刺激8 h組顯著下降(P＜0.05)，見圖3。

圖3 p-JAK2蛋白的表達(dá)

3.p-STAT3蛋白在低氧刺激8 h比低氧刺激0 h表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，AG490干預(yù)低氧刺激8 h組三種蛋白的表達(dá)較低氧刺激8 h組顯著下降(P＜0.05)，見圖4。

圖4 p-JAK2蛋白的表達(dá)

討 論

S100A4是一種EF-手型鈣結(jié)合蛋白，通過對鈣離子的調(diào)節(jié)及與靶蛋白的相互作用。在體內(nèi)發(fā)揮多種生物學(xué)作用，參與細(xì)胞周期活動、細(xì)胞分化、腫瘤生長以及細(xì)胞外基質(zhì)分泌活動等過程［1］。近年來的研究表明S100A4在腫瘤中呈高表達(dá)，并通過影響細(xì)胞骨架重排等作用機(jī)制來影響腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制［4-6］。本研究發(fā)現(xiàn)在低氧刺激下S100A4在胞漿和胞核中的表達(dá)比常氧下明顯升高，S100A4蛋白表達(dá)顯著高于常氧組，其他的研究也支持上述結(jié)論［7-8］。這表明低氧可對S100A4基因進(jìn)行調(diào)控。同時在低氧刺激下PAMSC細(xì)胞也從合成型轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谛?，?xì)胞開始增殖［3］。提示S100A4與PMASC的增殖有著密切的關(guān)系，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［2］。

JANUs激酶(januskinase，JAK)家族屬于胞漿部分的蛋白酪氨酸激酶，是作為受體和最終效應(yīng)分子之間的介導(dǎo)分子，主要參與細(xì)胞因子受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［9-10］。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducers and acti 2 vator of transcrip tions，STATs)是一類能與靶基因調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合的胞質(zhì)蛋白，是JAKs的下游底物。JAK-STAT通路廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、應(yīng)激、凋亡、炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)等［11］過程，此通路能夠?qū)⑿盘栄杆儆杉?xì)胞外傳遞至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)入核內(nèi)啟動RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯。研究表明低氧刺激可激活多種細(xì)胞中的JAK-STAT信號通路［12-14］。本研究中RPAMSC在低氧8 h組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)明顯高于常氧組，有顯著性差異，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［12-13］。許多研究表明JAKs或/和STATs在低氧或氧化應(yīng)激作用下被激活，提示STATs的磷酸化對低氧或氧化應(yīng)激環(huán)境中的細(xì)胞起調(diào)節(jié)作用［15］。AG490是可與受體酪氨酸激酶競爭結(jié)合位置，特異性阻滯各種細(xì)胞因子引起的JAK2和下游分子STAT3的的磷酸化激活，從而阻斷JAK-STAT信號通路。結(jié)果中AG490干預(yù)組較低氧8 h組p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達(dá)顯著降低，與Wang等［13］的結(jié)果一致。

我們的結(jié)果顯示在AG490的干預(yù)下，S100A4蛋白的表達(dá)比單純低氧組有顯著的降低。低氧調(diào)控S100A4表達(dá)的分子機(jī)制目前尚不清楚，低氧誘導(dǎo)的關(guān)鍵性分子事件是Hif-1(hypoxia induced factor 1)的激活，Hif-1是由Hif-1α和Hif-1β組成的異源二聚體，與低氧反應(yīng)元件(hypoxia responsive element，HRE)結(jié)合后激活靶基因如VEGF、EPO、Glut1等轉(zhuǎn)錄［16］。有研究表明在S100A4基因的第一個啟動子中含有HRE，Hif-1-1α可通過與HRE的結(jié)合來激活S100A4基因的轉(zhuǎn)錄［8，17］。Xu等［18］闡明了在腎母細(xì)胞瘤中STAT3能夠調(diào)節(jié)AKt的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)生長因子誘導(dǎo)的HIF-1的高表達(dá)。他們在體外實(shí)驗(yàn)中，以小分子抑制劑作用于STAT3實(shí)現(xiàn)了阻斷HIF-1的表達(dá)。提示AG490可能通過抑制JAK2-STAT3信號通路，間接影響了S100A4的表達(dá)。

綜上所述，PAMSC在低氧刺激下S100A4蛋白的表達(dá)增高，提示S100A4在PAMSC的增殖中起重要的作用，進(jìn)一步揭示低氧肺動脈高壓的形成機(jī)制。同時AG490可間接抑制S100A4的表達(dá)，提示AG490可用于減緩肺動脈高壓的發(fā)病進(jìn)程。

1 Donato R.S100:a multigenic family of calcium-modulated proteins of the EF-hand type with intracellular and extracellular functional roles［J］.Int J Biochem Cell Biol，2001，33(7):637-668.

2 Frid MG，Li M，Gnanasekharan M，et al.Sustained hypoxia leads to the emergence of cells with enhanced growth，migratory，and promitogenic potentials within the distal pulmonary artery wall［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2009，297(6):L1059-L1072.

3 Bai L，Yu Z，Qian G，et al.SOCS3 was induced by hypoxia and suppressed STAT3 phosphorylation in pulmonary arterial smooth muscle cells［J］.Respir Physiol Neurobiol，2006，152(1):83-91.

4 Sherbet GV，Lakshmi MS.S100A4(MTS1)calcium binding protein in cancer growth，invasion and metastasis［J］.Anticancer Res，1998，18(4A):2415-2421.

5 Lakshmi MS，Parker C，Sherbet GV.Expression of the transmembraneglycoprotein CD44 and metastasis associated 18A2/MTS1 gene in B16 murine melanoma cells［J］.Anticancer Res，1997，17(5A):3451-3455.

6 Ambartsumian N，Klingelhofer J，Grigorian M，et al.The metastasis-associated Mts1(S100A4)protein could act as an angiogenic factor［J］.Oncogene，2001，20(34):4685-4695.

7 Zhang R，F(xiàn)u H，Chen D，et al.Subcellular distribution of S100A4 and its transcriptional regulation under hypoxic conditions in gastric cancer cell line BGC823［J］.Cancer Sci，2010，101(5):1141-1146.

8 Liao SH，Zhao XY，Han YH，et al.Proteomics-based identification of two novel direct targets of hypoxia-inducible factor-1 and their potential roles in migration/invasion of cancer cells［J］.Proteomics，2009，9(15):3901-3912.

9 Fujitani Y，Hibi M，F(xiàn)ukada T，et al.An alternative pathway for STAT activation that is mediated by the direct interaction between JAK and STAT［J］.Oncogene，1997，14(5A):751-761.

10 Horvath CM，Darnell JE.The state of the STATs:recent developments in the study of signal transduction to the nucleus［J］.Curr Opin Cell Biol，1997，9(2):233-239.

11 O＇Shea JJ，Murray PJ.Cytokine signaling modules in inflammatory responses［J］.Immunity，2008，28(4):477-487.

12 Ruscher K，F(xiàn)reyer D，Karsch M，et al.Erythropoietin is a paracrine mediator of ischemic tolerance in the brain:evidence from an in vitro model［J］.J Neurosci，2002，22(23):10291-10301.

13 Wang GS，Qian GS，Zhou DS，et al.JAK-STAT signaling pathway in pulmonary arterial smooth muscle cells is activated by hypoxia［J］.Cell Biol Int，2005，29(7):598-603.

14 Lin AM，Dung SW，Chen CF，et al.Hypoxic preconditioning prevents cortical infarction by transient focal ischemia-reperfusion［J］.Ann N Y Acad Sci，2003，993:168-178.

15 Negoro S，Kunisada K，F(xiàn)ujio Y，et al.Activation of signal transducer and activator of transcription 3 protects cardiomyocytes from hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress through the upregulation of manganese superoxide dismutase［J］.Circulation，2001，104(9):979-981.

16 Airley RE，Mobasheri A.Hypoxic regulation of glucose transport，anaerobic metabolism and angiogenesis in cancer:novel pathways and targets for anticancer therapeutics［J］.Chemotherapy，2007，53(4):233-256.

17 Ke Q，Costa M.Hypoxia-inducible factor-1(HIF-1)［J］.Mol Pharmacol，2006，70(5):1469-1480.

18 Xu Q，Briggs J，Park S，et al.Targeting Stat3 blocks both HIF-1 and VEGF expression induced by multiple oncogenic growth signaling pathways［J］.Oncogene，2005，24(36):5552-5560.