王耀文， 孟憲生， 包永睿， 王 帥

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧大連116600)

人參為五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根。具有大補元氣復(fù)脈固脫、補脾益肺、生津、安神之功效［1］。用于體虛欲脫、肢冷脈微、脾虛食少、肺虛喘咳、津傷口渴、內(nèi)熱消渴、久病虛贏、驚悸失眠、陽痿宮冷、心力衰竭、心源性休克等［2］。人參皂苷大多具有增加白細(xì)胞數(shù)量、提高人體免疫力、促進物質(zhì)代謝、抗疲勞、抗衰老等作用［3］。本研究設(shè)計正交實驗，以HPLC同時定量，優(yōu)選出人參皂苷的提取條件，并以連二亞硫酸鈉為造模藥物，建立心肌細(xì)胞缺氧模型，以MTT測定心肌細(xì)胞存活率水平;考察所得優(yōu)化工藝對心肌細(xì)胞的保護作用，確保療效，為人參臨床療效的發(fā)揮建立有效保障。

1 材料

1.1 儀器與藥材

Agilent1100-DAD液相色譜儀;CP225D電子分析天平(德國Sartorius，十萬分之一);微量移液器 (法國吉爾森科技有限公司);MiLLi-Q超純水處理裝置 (美國MiLLipore公司);AE31型倒置相差顯微鏡 (Motic公司);UNRISE酶標(biāo)儀 (瑞士TECAN公司)。

人參藥材由大連市開發(fā)區(qū)陽光大藥房夠買，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為 Panax ginseng C.A.Mey.;人參皂苷 Rb1、Re、Rg1(批號分別為 110704-200420、110754-200320、110703-200726，購自中國藥品生物制品檢定所)。

1.2 動物 新生SD乳鼠 (1～3d)，購自大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，達(dá)到國家清潔級標(biāo)準(zhǔn)，合格證號為SCXX(遼)-2008-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交實驗法優(yōu)選人參提取工藝 選擇提取時間、提取次數(shù)、溶劑用量、溶液含醇量4個因素，對主要影響因素各取3個水平，進行L9(34)正交試驗考察，優(yōu)選最佳提取條件［4-6］。每份取等量人參粉末，用乙醇回流提取，過濾，濾液減壓回收乙醇，減壓干燥得干膏。按下述方法分別制備樣品溶液并進行測定。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗［7］Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為水 (A)-乙腈 (B)，二元線性梯度洗脫0～25 min:22%→23%B(78%A→77%A);25～28 min:22%B→ 30%B(77%A→70%A);28～60 min:30%B→34%B(70%A→66%A);60～80 min:34%B→40%B(66%A→60%A);80～90 min:40%B→50%B(60%A→50%A);90～100 min:50%B→60%B(50%A→40%A);體積流量1 mL/min;柱溫25℃;檢測波長203 nm;進樣量15 μL。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1對照品適量，加甲醇制成含 Rg10.218 mg/mL，Re 0.252 mg/mL，Rb10.366 mg/mL的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備 精密吸取人參提取液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.5 細(xì)胞實驗處理

2.5.1 原代乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)［8-9］取新生SD乳鼠若干只，無菌條件下開胸取心，用PBS液洗凈。并在適量冷PBS中將心室剪成碎塊放入培養(yǎng)皿里，用混合消化液多次消化，用培養(yǎng)液終止消化，離心，沉淀物加入培養(yǎng)液過200目篩，收集細(xì)胞懸液，以差速貼壁法分離純化心肌細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，轉(zhuǎn)接于96孔板里培養(yǎng)，獲得較純的心肌細(xì)胞，再繼續(xù)培養(yǎng)。選生長狀態(tài)佳者于72 h后進行實驗。

2.5.2 含藥血漿的獲得 將小鼠隨機分為10組，一組空白對照組，其余9組為正交試驗組。灌胃3 d，眼球取血，置Ep管中，離心，吸取上清液即為含藥血漿，經(jīng)56℃30 min滅活處理后，用微孔濾膜過濾除菌，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5.3 分組 取接種完成的96孔板的心肌細(xì)胞隨機分為10組 (每組5孔細(xì)胞):①對照組:細(xì)胞板中加入Na2S2O437℃培養(yǎng)1 h，換入正常培養(yǎng)液復(fù)氧1 h后，培養(yǎng)24 h;②9組正交試驗組:含藥血漿 +Na2S2O4組，Na2S2O4培養(yǎng)1 h，正常DMEM/F12培養(yǎng)液復(fù)氧1 h后，加入含藥血漿37℃培養(yǎng)24 h。

2.5.4 MTT法測定心肌細(xì)胞活力［10］將心肌細(xì)胞接種于96孔板中，經(jīng)上述實驗分組處理后，每孔避光加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL)，37℃繼續(xù)孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μLDMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物完全溶解。于波長492 nm處測各孔OD值，計算細(xì)胞活力，見表1［11］～2。

表1 人參正交試驗

表2 方差分析

以直觀分析表1及方差分析表2對實驗結(jié)果進行評價，結(jié)果表明，影響提取工藝的因素主次順序為B＞D＞C＞A，其中提取次數(shù) (B)對藥材提取率影響最大，具有顯著性意義 (P＜0.05)。因此篩選確定提取條件為A2B3C2D3，即以8倍量80%乙醇回流提取3次，每次1 h。

2.6 正交驗證試驗 為了認(rèn)證A2B3C2D3結(jié)果是否為最佳提取工藝，分別稱取3份等量人參，按照人參正交試驗中最佳提取工藝進行提取，其有效成分測定與藥效學(xué)試驗同上，結(jié)果見表3。經(jīng)過藥效學(xué)與有效組分結(jié)合篩選出的結(jié)果與正交試驗得到的最佳提取工藝完全一致，因此本次試驗的最佳提取工藝結(jié)果為A2B3C2D3，且藥效學(xué)結(jié)果穩(wěn)定。

表3 人參最佳提取工藝驗證結(jié)果

2.7 相關(guān)性分析 通過SPSS 17.0軟件將9組樣品的人參皂苷Rg1、Re、Rb1含有量分別與細(xì)胞存活率進行Pearson相關(guān)系數(shù)分析，結(jié)果見表4。

表4 相關(guān)性分析

人參皂苷Rg1、Re、Rb1含有量與存活率均呈正向直線相關(guān)，3種人參皂苷與存活率相關(guān)性為Rg1＞Rb1＞Re。

3 討論

3.1 中藥的有效成分復(fù)雜，在試驗過程中，由于人參的成分頗多，有皂苷類、有機酸類、脂類等成分構(gòu)成，這些成分對總皂苷藥效的影響并不清楚，若單純以人參化學(xué)指標(biāo)和總皂苷產(chǎn)率的高低來優(yōu)選最佳提取工藝，已不能說明所提取成分藥效是否最佳。因此，本實驗采用將人參提取工藝與藥效雙重指標(biāo)相結(jié)合的方法，使優(yōu)選出的提取工藝更加有依據(jù)。驗證實驗表明，本實驗通過將活性成分和藥效相結(jié)合的方法使中藥提取產(chǎn)物突出其某方面療效，并反映出本研究的設(shè)計方法和技術(shù)路線是科學(xué)、合理、必要和可行的，為中藥提取工藝的優(yōu)化提供了一種新的思路。

3.2 采用了正交試驗進行人參提取工藝的優(yōu)選，正交設(shè)計具有“均勻分散，整齊可比”的特點，可減少試驗次數(shù)，避免眾多交互作用的解釋困難。與以往正交試驗單一的考察指標(biāo)相比，本研究選擇多種活性成分作為指標(biāo)，建立合理的關(guān)聯(lián)，并設(shè)不同權(quán)重系數(shù)來區(qū)分因素水平間差別，更好地達(dá)到了工藝優(yōu)化的目的。驗證結(jié)果表明，這種設(shè)計方法是科學(xué)、合理、可行的。

3.3 本實驗直接應(yīng)用Na2S2O4作用于原代心肌細(xì)胞，Na2S2O4作為一種氧清除劑，不僅不會損傷細(xì)胞膜，且一般在給予適當(dāng)劑量下即可清除培養(yǎng)基中的氧，造成心肌細(xì)胞缺氧，可更好的建立心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，并通過MTT比色分析法測定活細(xì)胞數(shù)，其操作簡單，客觀準(zhǔn)確，能反映細(xì)胞與藥物的關(guān)系，便于實驗室開展。

3.4 本實驗對人參中3種皂苷成分與心肌細(xì)胞存活率進行相關(guān)性分析，證明人參中3種皂苷成分是治療心肌缺氧的有效成分，以3種皂苷成分作為評價人參提取工藝的指標(biāo)成分是合理的，并為以化學(xué)成分作為提取工藝的評價指標(biāo)提供了理論依據(jù)。

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