田維毅， 王文佳， 韓 潔， 王慶學(xué)， 楊 柱

(貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550002)

酒精引起的健康損害已成為當(dāng)代社會(huì)的一個(gè)嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。肝臟是酒精損害的最主要臟器，近年來發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞凋亡在酒精性肝病的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用，已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。Caspases(Cysteinyl asparate specific proteinase)是一種特異性蛋白酶，因其介導(dǎo)細(xì)胞凋亡而備受關(guān)注［1］。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，Caspase以依賴線粒體和非依賴線粒體兩條途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其中Caspase8和Caspase3發(fā)揮著重要作用。Caspase8是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)者，被激活后可引起下游Caspase“瀑布式”激活，且可將凋亡信號從非依賴線粒體途徑傳遞到線粒體途徑，把死亡受體通路和線粒體通路聯(lián)系起來，放大凋亡信號;Caspase3是線粒體-細(xì)胞色素 C途徑、死亡配體和(或)受體途徑、顆粒酶B途徑的共同通路，在凋亡過程中處于核心位置，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶和主要效應(yīng)因子［2］。在前期研究中，我們初步篩選出葛根散 (金·張子和《儒門事親》)、石膏湯 (解酒驗(yàn)方)、葛花解酲湯 (元·李東桓《脾胃論》)等3個(gè)經(jīng)方/驗(yàn)方能有效解酒防醉、保護(hù)酒精導(dǎo)致的肝功能損傷、緩解肝組織病理損害、減少肝細(xì)胞凋亡［3-5］。為了深入探索上述解酒方減少肝細(xì)胞凋亡的部分機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制急性酒精中毒小鼠模型，考察上述解酒方對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Caspase3/8活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購自貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證號:SCXK(黔)20020001］。

1.2 主要儀器與試劑 AB135-S型梅特勒托利多電子天平(梅特勒托利多上海公司);ELx800全自動(dòng)酶標(biāo)儀 (美國biotek);56%(V/V)紅星二鍋頭白酒為北京紅星股份有限公司產(chǎn)品 (批號001215);ALT、AST檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;Caspase3及Caspase8活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥材 實(shí)驗(yàn)用方劑包括葛根散 (金·張子和《儒門事親》)、石膏湯 (解酒驗(yàn)方:石膏12 g、葛根10 g、干姜6 g)、葛花解酲湯 (元·李東桓《脾胃論》)，組方藥材購自貴陽同仁堂大藥房，經(jīng)鑒定為正品，按原方比例常規(guī)制備水煎劑 (生藥濃度為1 g/mL)備用。

1.4 動(dòng)物分組與處理 將小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、各方大/中/小劑量給藥組，每組15只。根據(jù)藥理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥折算方法，以成人常規(guī)用量折算實(shí)驗(yàn)小鼠用藥量，各給藥組以不同濃度的中藥水煎劑0.2 mL/(次·只)灌胃。各方實(shí)驗(yàn)給藥劑量分別為:葛根散0.2 g/0.1 g/0.05 g(生藥)/10 g(小鼠體質(zhì)量);石膏湯0.1 g/0.05 g/0.025 g(生藥)/10 g(小鼠體質(zhì)量);葛花解酲湯0.4 g/0.2 g/0.1 g(生藥)/10 g(小鼠體質(zhì)量)，每天1次，正常對照組和模型對照組代以等量蒸餾水;根據(jù)前期摸索劑量，給藥30 min后，模型對照組和各給藥組用56%(V/V)紅星二鍋頭白酒灌胃，0.15 mL/10 g，每天1次，正常對照組代以等量蒸餾水。連續(xù)灌胃10 d，所有動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)。

1.5 小鼠活動(dòng)狀況觀察 所有造模小鼠出現(xiàn)嗜睡、步態(tài)蹣跚、活性減少、身子發(fā)抖等狀態(tài)，其余小鼠活動(dòng)正常。

1.6 小鼠血清ALT、AST水平檢測 末次灌胃12 h后開始禁食 (不禁水)，24 h后每只小鼠經(jīng)眼眶采血，低溫離心制備血清，按試劑盒要求檢測ALT、AST水平。

1.7 小鼠肝組織Caspase3和Caspase8活性檢測 各組動(dòng)物采血后，頸椎脫臼處死，分別取肝臟組織20～40 mg制備組織勻漿，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作方法檢測小鼠肝組織裂解液中Caspase3/8活性。所有操作盡量在冰浴中進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示，組間采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

為了便于復(fù)方之間的效果分析，各項(xiàng)指標(biāo)以各方最佳效果劑量組作為參比組。

2.1 3首解酒方對急性酒精中毒小鼠血清ALT、AST水平的影響 檢測結(jié)果見表1。

(1)模型對照組小鼠血清ALT、AST水平較正常對照組顯著升高(P＜0.01)。(2)3首復(fù)方最佳效果劑組小鼠鼠血清ALT、AST水平較模型對照組顯著降低 (P＜0.01)，但與正常對照組相比明顯較高 (P＜0.05或P＜0.01)。(3)葛花解酲湯最佳效果劑量組小鼠血清ALT、AST水平在3首復(fù)方中最低，其中ALT水平與其余2首復(fù)方差異顯著 (P＜0.01)，AST水平與其余2首復(fù)方比較無差異顯著性 (P＞0.05)。 (4)3首復(fù)方最佳效果劑量組小鼠血清ALT、AST水平與最差效果劑量組之間具有顯著性差異 (P＜0.01)，但葛花解酲湯各劑量組小鼠之間血清AST水平除外 (P＞0.05)。

表1 3首解酒方對急性酒精中毒小鼠血清ALT、AST水平的影響(±s)

表1 3首解酒方對急性酒精中毒小鼠血清ALT、AST水平的影響(±s)

注:▲為各組除去死亡動(dòng)物之后實(shí)際檢測數(shù) (動(dòng)物死亡原因包括醉死和操作意外死亡);a本指標(biāo)最佳效果方劑;b本方劑本指標(biāo)最佳效果劑量;與正常對照組比較，*P ＞0.05，＊＊P＜0.05，＊＊＊P ＜0.01;與模型對照組比較，△ P＞0.05，△△P ＜0.05，△△△P ＜0.01;與本指標(biāo)最佳效果方劑比較，§P＞0.05，§§P＜0.05，§§§P＜0.01;與本方劑最佳劑量組比較，#P＞0.05，##P＜0.05，###P＜0.01。下同。

組 別 動(dòng)物/只▲ ALT/(U·L－1) AST/(U·L－1)正常對照組13 53.27 ±6.38 66.95 ±12.65模型對照組 14 177.39±14.17＊＊＊ 138.88±15.97＊＊＊葛根散大劑量組 12 95.34±11.29b＊＊△△△§§§ 100.38±10.26#中劑量組 15 106.23 ±14.87# 95.94 ±13.11b＊＊＊△△△§小劑量組 13 138.71 ±13.63### 130.55±10.20###石膏湯大劑量組 14 101.96 ±11.73b＊＊＊△△△§§§ 89.66±10.71b＊＊＊△△△§中劑量組 13 109.34 ±9.94# 100.33±10.64#小劑量組 13 167.11 ±11.99### 123.08±12.05###葛花解酲湯大劑量組 12 71.82±11.27ab＊＊△△△ 91.33±11.08#中劑量組 15 75.26 ±10.37# 96.40±11.69#小劑量組 13 96.46 ±10.28### 87.63±8.37ab＊＊△△△

2.2 葛根散等3首解酒方對急性酒精中毒小鼠Caspase3/8活性的影響 檢測結(jié)果見表2。

(1)模型對照組小鼠肝組織Caspase3/8活性較正常對照組顯著升高 (P＜0.01)。(2)3首復(fù)方最佳效果劑量組小鼠肝組織Caspase3/8活性與模型對照組比較顯著降低(P＜0.01)，但石膏湯各組肝組織Caspase3活性除外 (P＞0.05);3首復(fù)方最佳效果劑量組小鼠肝組織Caspase3/8活性與正常對照組相比明顯較高 (P＜0.01)，但葛花解酲湯各組肝組織Caspase8活性除外 (P＞0.05)。(3)葛根散最佳效果劑量組小鼠肝組織Caspase3活性在3首復(fù)方中最低，與其余2首復(fù)方差異顯著 (P＜0.01);葛花解酲湯肝組織Caspase8活性在3首復(fù)方中最低，與其余2首復(fù)方差異顯著(P＜0.05)。 (4)葛根散和葛花解酲湯劑量組間肝組織Caspase3活性差異顯著 (P＜0.01);石膏湯和葛花解酲湯劑量組間肝組織Caspase8活性差異顯著 (P＜0.01)。

3 討論

酒精性肝病 (ALD)是一種由于過度飲酒引起的中毒性肝臟疾病，在我國呈逐年上升趨勢，已成為繼病毒性肝炎后導(dǎo)致肝損害的第二大病因。近來研究表明，酒精是肝細(xì)胞的一種凋亡誘導(dǎo)劑，而肝細(xì)胞凋亡ALD的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用，已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一［6］。在前期研究中，我們初步篩選出本文中葛根散、石膏湯、葛花解酲湯有效解酒防醉、保護(hù)酒精導(dǎo)致的肝功能損傷、緩解肝組織病理損害、減少肝細(xì)胞凋亡［3-5］。為了深入探索上述解酒方減少肝細(xì)胞凋亡的部分機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制急性酒精中毒小鼠模型，考察上述解酒方對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Caspase3/8活性的影響。Caspases(Cysteinyl asparate specific proteinase)是一種特異性蛋白酶，以執(zhí)行細(xì)胞凋亡而受到廣泛關(guān)注［1］。Caspase3/8在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用:Caspase8是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)者，Caspase3在凋亡過程中處于核心位置，是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)因子［3-4］。ALT和AST在肝細(xì)胞中均有存在，當(dāng)肝細(xì)胞膜受損或細(xì)胞壞死時(shí)，便進(jìn)入血液，通過測定其在血清中的活性，即可反映肝細(xì)胞受損情況及損傷程度。表1結(jié)果顯示，模型小鼠血清ALT、AST水平顯著升高，提示肝細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷。

表2 3首解酒方對急性酒精中毒小鼠肝組織Caspase3/8活性 (±s)

表2 3首解酒方對急性酒精中毒小鼠肝組織Caspase3/8活性 (±s)

組別 動(dòng)物/只 肝組織Caspase3活性/(U·mg pro－1) 肝組織Caspase8活性/(U·mg pro－1)13 1.26±0.27 0.81±0.21模型對照組 14 6.63±0.59＊＊＊ 2.67±0.32＊＊＊葛根散大劑量組 12 2.29±0.61ab＊＊＊△△△ 1.70±0.29#中劑量組 15 3.76±0.51### 1.63 ±0.31b＊＊＊△△△§§小劑量組 13 4.89±0.44### 1.69±0.31#石膏湯大劑量組 14 5.94±0.42#1.61 ±0.29b＊＊＊△△△§§中劑量組 13 5.89±0.40b＊＊＊a§§§ 1.99±0.24#小劑量組 13 6.07±0.52# 2.49±0.21###葛花解酲湯大劑量組 12 2.52±0.39b＊＊＊△△△§§§ 1.09±0.28ab＊△△△中劑量組 15 3.07±0.41# 1.27±0.36#小劑量組 13 4.44±0.45### 1.96±0.30正常對照組###

本實(shí)驗(yàn)考察的3首解酒方劑中，葛根散解熱生津、健脾和胃，石膏湯解熱除煩、生津止渴，葛花解酲湯分消酒濕、溫中健脾，三方都主治飲酒過度、酒毒內(nèi)蘊(yùn)之證?，F(xiàn)代研究表明，乙醇代謝產(chǎn)生的乙醛是使人喝酒后產(chǎn)生行為異常、惡心欲吐、昏迷不適等急性醉酒癥狀主要原因［6］;而酒精引起肝細(xì)胞破壞是導(dǎo)致酒精性慢性肝損害的關(guān)鍵始動(dòng)因素。我們前期研究顯示，上述3方都具有明顯醒酒防醉作用，能明顯改善實(shí)驗(yàn)小鼠昏睡、攀附力量降低、步態(tài)蹣跚、身子發(fā)抖等“醉酒”表現(xiàn)，其機(jī)制可能與其能夠明顯降低血乙醇水平和保護(hù)肝細(xì)胞的作用密切相關(guān)［3-5］。研究表明，反復(fù)肝細(xì)胞損傷是導(dǎo)致酒精性慢性肝損害的重要機(jī)制，而酒精引起肝細(xì)胞異常凋亡是其損害肝細(xì)胞的重要方面;中醫(yī)藥能有效醒酒防醉，治療飲酒過度、酒毒內(nèi)蘊(yùn)之證，同時(shí)對慢性酒精性肝病遠(yuǎn)期療效較好［7-8］。因此，中藥防治慢性酒精性肝損傷是否與其緩解肝細(xì)胞凋亡、保護(hù)肝細(xì)胞有關(guān)，就成了研究解酒中藥遠(yuǎn)期療效機(jī)制的核心內(nèi)容之一。在我們考察3首解酒方保護(hù)肝細(xì)胞的機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們可以明顯緩解肝細(xì)胞凋亡水平［5］。本實(shí)驗(yàn)表2結(jié)果顯示，3首解酒方均能顯著降低模型小鼠肝組織Caspase3/8活性，提示3首復(fù)方具有抑制肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制與其降低Caspase3/8活性有關(guān)。從3方不同劑量干預(yù)模型小鼠肝組織Caspase3/8活性能力的差異，提示其效應(yīng)具有劑量依賴性?？傊?，本實(shí)驗(yàn)初步觀察到葛根散等3首解酒方對急性酒精中毒小鼠肝組織Caspase3/8活性具有不同程度抑制作用，為深入研究各方解酒防醉、防治慢性酒精性肝病積累了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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