段琦梅， 梁宗鎖*， 楊東風(fēng)， 劉文婷

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌712100;2.陜西省中藥指紋圖譜與天然產(chǎn)物庫研究中心，陜西楊凌712100)

我國擁有豐富的藥用植物資源，其中很多藥用植物的作用都是通過抑菌作用來表現(xiàn)的［1-2］。從天然植物資源中尋找和開發(fā)綠色藥品既可以避免由于抗生素的廣泛使用而帶來的細(xì)菌耐藥性問題和藥物的不良反應(yīng)，又可以避免化學(xué)合成藥物的開發(fā)難度大及明顯的毒副作用，因此就顯得尤為重要，并且成為當(dāng)前新藥發(fā)展的一種趨勢(shì)。目前，從天然物質(zhì)中尋找抗菌活性的物質(zhì)用于治療疾病越來越引起人們的關(guān)注［3-4］。

黃芪是我國傳統(tǒng)的補(bǔ)益用藥［5］。具有抗氧化、抗衰老、抗應(yīng)激、抗病毒、抗腫瘤的作用，對(duì)人體核酸代謝、細(xì)胞代謝、細(xì)菌及病毒感染等有顯著作用，對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等均有廣泛的影響［5-6］。黨參具有健脾益肺、補(bǔ)中益氣的功能［7］，具有抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等作用［8-10］。黃芪和黨參中都富含黃酮、多糖、萜類、酚酸類、多種皂苷以及微量元素、氨基酸、亞油酸、膽堿、生物堿等［11－13］，其中許多化合物具有較強(qiáng)的生物活性。目前，關(guān)于黃芪、黨參提取物抗菌活性的研究少有報(bào)道，為了探討黃芪、黨參乙醇提取物的生物活性，本研究對(duì)黃芪、黨參藥材的乙醇提取物進(jìn)行抗菌試驗(yàn)研究，以期為充分利用黃芪、黨參藥材提供參考依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 供試材料 選用試驗(yàn)材料經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)生命學(xué)院張躍進(jìn)教授鑒定為黃芪Astragalus membranaceus和黨參Codonopsis pilosula。處理方法為:取清洗干凈的黃芪、黨參根部樣品置于50℃烘箱中干燥、粉碎并過40目篩，保存于密封容器中備用。

1.2 試驗(yàn)菌株 所用的15種菌株分別為:金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus);綠膿假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa);大腸埃希氏菌(Escherichia coli);卡他布朗漢姆氏菌 (Branhamella catarrhalis);表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermdis);甲型溶血性鏈球菌 (Streptococcus hemolysis-α);乙型溶血性鏈球菌 (Streptococcus hemolysis-β);傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhi);肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae);福氏志賀氏菌 (Shigella flexneri);肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae);變形桿菌(Proteus sp.);炭疽芽胞桿菌 (Bacillus anthracis);枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis);白色假絲酵母菌 (Candida albicans)。

以上15株試驗(yàn)菌株凍干菌種均由中國藥品生物制品檢定所中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心提供。

1.3 主要試驗(yàn)儀器及試劑 電熱恒溫培養(yǎng)箱;壓力蒸氣滅菌器;生物安全柜;96孔細(xì)胞培養(yǎng)板;電子天平;LB培養(yǎng)基 (美國Sigma公司);二甲基亞砜 (DMSO)，(西安化學(xué)試劑廠);營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 (北京陸橋技術(shù)有限公司);無支原體新生牛血清 (杭州四季青生物工程材料有限公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品的處理及樣品液配制 分別精密稱取3 g左右的黃芪、黨參粉末置于錐形瓶中，加入95%乙醇20 mL，在超聲波清洗器中超聲提取30 min，過濾，保留濾液，并對(duì)濾渣同樣處理后過濾，合并濾液，將提取液進(jìn)行濃縮為干樣，黃芪的提取得率為4.365%，黨參的提取得率為1.984%。將黃芪、黨參醇提物干樣分別溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，對(duì)應(yīng)的黃芪相對(duì)提取物的質(zhì)量濃度為0.1 g/mL，黨參相對(duì)提取物的質(zhì)量濃度為0.28 g/mL。

2.2 抗菌試驗(yàn) 本試驗(yàn)內(nèi)容中的試驗(yàn)菌液配制、最小抑菌濃度、最小殺菌濃度的測(cè)定 參照《中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局新藥臨床前研究指導(dǎo)原則》和《微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)》中的相關(guān)章節(jié)，分別采用瓊脂微孔擴(kuò)散法、連續(xù)二倍梯度液體稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度 (Minimum inhibitory concentration，MIC)，液體轉(zhuǎn)染法測(cè)定最小殺菌濃度 (Minimum bactericidal concentration，MBC)并略有改進(jìn)［14-15］。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 黃芪、黨參乙醇提取物對(duì)試驗(yàn)菌的MIC

3.1.1 瓊脂平板微孔擴(kuò)散法抗菌試驗(yàn) 黃芪醇提物對(duì)卡他布朗漢姆氏菌、表皮葡萄球菌、甲型、乙型溶血性鏈球菌、枯草芽胞桿菌、炭疽芽胞桿菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌有抑制作用。其中，對(duì)乙型溶血性鏈球菌、炭疽桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌的作用尤為明顯。對(duì)每種菌的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為0.1、0.1、0.1、0.01、0.05、0.025、0.1、0.05、0.1 g/mL。

黨參醇提物對(duì)卡他布朗漢姆氏菌、表皮葡萄球菌、甲型、乙型溶血性鏈球菌、枯草芽胞桿菌、炭疽芽胞桿菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌、傷寒沙門氏菌、變形桿菌有抑制作用。

3.1.2 液體稀釋法抗菌試驗(yàn) 黃芪醇提物MIC測(cè)定結(jié)果可知，黃芪醇提物對(duì)乙型溶血性鏈球菌的 MIC達(dá)10 mg/mL，在0.625～20 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)顯示對(duì)其余試驗(yàn)菌株無抑制作用。黨參醇提物抗菌試驗(yàn)結(jié)果表明，在1.7～56 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，黨參醇提物對(duì)所用試驗(yàn)菌株均無抑制作用。

3.1.3 黃芪、黨參醇提物對(duì)菌株的MIC 綜合液體稀釋法和瓊脂平板微孔擴(kuò)散法抗菌試驗(yàn)的結(jié)果，黃芪、黨參醇提物對(duì)15株常見標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC結(jié)果見表1。

3.2 黃芪、黨參醇提物對(duì)試驗(yàn)菌的MBC 試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪醇提物質(zhì)量濃度為0.1 g/mL，黨參醇提物質(zhì)量濃度為0.28 g/mL時(shí)，對(duì)所有試驗(yàn)菌均無滅活作用。

3.3 常用化學(xué)消毒劑、有機(jī)溶劑的抗菌試驗(yàn) 為了使脂溶性的有效成分能夠充分溶解，在抑菌試驗(yàn)中常采用有機(jī)溶劑助溶。為了研究采用有機(jī)溶劑在抗菌試驗(yàn)中對(duì)試驗(yàn)效果的影響，使試驗(yàn)數(shù)據(jù)更科學(xué)、更具有參考價(jià)值，本研究設(shè)計(jì)如下試驗(yàn):選擇常用的有機(jī)溶劑乙醇、二甲基亞砜，研究乙醇、二甲基亞砜這些常見的有機(jī)溶劑在抗菌試驗(yàn)中作為溶劑時(shí)，它們本身對(duì)細(xì)菌的抑制程度。

表1 黃芪、黨參乙醇提取物對(duì)15株標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC

試驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度乙醇對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌有明顯的抑制作用。二甲基亞砜對(duì)細(xì)菌無抑制作用。

4 結(jié)論與討論

關(guān)于黃芪、黨參的抗菌活性曾有一些研究報(bào)道，其中，周建新等［16］對(duì)黃芪提取物作用于5種菌株進(jìn)行研究;王俊淇等［17］對(duì)黨參脂作用于3種菌的抗菌活性進(jìn)行了研究。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，采用體外抗菌試驗(yàn)來研究黃芪、黨參乙醇提取物對(duì)常見15種細(xì)菌的抑菌活性，并且考慮試驗(yàn)中所用溶劑對(duì)抗菌活性的影響。黃芪、黨參醇提物抗菌活性的試驗(yàn)結(jié)果表明:黃芪醇提物對(duì)卡他布朗漢姆氏菌、表皮葡萄球菌、甲型、乙型溶血性鏈球菌、枯草芽胞桿菌、炭疽芽胞桿菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌有抑制作用。其中，對(duì)乙型溶血性鏈球菌、炭疽桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌的作用尤為明顯。對(duì)每種菌的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為0.1、0.1、0.1、0.01、0.05、0.025、0.1、0.05、0.1 g/mL。黨參醇提物不但對(duì)卡他布朗漢姆氏菌、表皮葡萄球菌、甲型、乙型溶血性鏈球菌、枯草芽胞桿菌、炭疽芽胞桿菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌有抑制作用，同時(shí)對(duì)變形桿菌、傷寒沙門氏菌有抑制作用。對(duì)應(yīng)的最小抑菌質(zhì)量濃度除了對(duì)金黃色葡萄球菌的為0.14 g/mL外，其余的都為0.28 g/mL。

對(duì)于體外抗菌試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析表明:黃芪提取物對(duì)試驗(yàn)中所選用的9個(gè)試驗(yàn)菌株有明顯的抑制作用，尤其是對(duì)乙型溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和炭疽桿菌的作用較明顯，抑制作用表現(xiàn)得更為顯著。黨參醇提物對(duì)11個(gè)試驗(yàn)菌株具有明顯的抑制作用。黃芪、黨參提取物中含有多種活性成分，包括有黃酮類、皂苷類等成分，有試驗(yàn)表明，黃酮類和皂苷類均具有較好的抗菌、抑菌活性［18-20］。由于具有這些活性成分作為物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，黃芪、黨參醇提物表現(xiàn)出具有一定的抑菌作用。由于黃芪、黨參醇提物所含活性成分的復(fù)雜多樣性，本研究中僅對(duì)黃芪、黨參醇提物生物活性做了初步試驗(yàn)，要進(jìn)一步研究其醇提物中哪些成分具有抑菌活性及其抑菌機(jī)理，還需進(jìn)一步進(jìn)行深入的研究和探討。

以往對(duì)黃芪、黨參提取物進(jìn)行的研究報(bào)道中，選用乙醇作為溶劑，這對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性就有了一定的影響。為了讓所選擇的溶劑既能讓被研究物溶解又不能對(duì)所使用細(xì)菌起到抑菌作用，給抑菌試驗(yàn)選擇合適的有機(jī)溶劑提供依據(jù)，本研究中設(shè)計(jì)了常用有機(jī)溶劑的抗菌試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了高濃度的乙醇具有較強(qiáng)抑菌及殺菌作用，其作用對(duì)象主要為革蘭陽性菌及部分革蘭陰性菌。75%乙醇在臨床上經(jīng)常單獨(dú)使用于皮膚消毒或作為脫碘劑與碘酊聯(lián)合。在抗菌試驗(yàn)的設(shè)計(jì)中，不應(yīng)直接使用含有乙醇的樣本用于抗菌試驗(yàn)，應(yīng)考慮乙醇提取物中乙醇的因素，避免乙醇對(duì)抗菌活性結(jié)果的影響。在本試驗(yàn)中，將含乙醇的提取物樣本進(jìn)行濃縮和干燥，再用對(duì)細(xì)菌、細(xì)胞生長(zhǎng)無影響的二甲基亞砜 (DMSO)作溶劑來溶解提取物干燥品，避免乙醇對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，使試驗(yàn)結(jié)果更加真實(shí)可信。

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