哈 飛， 李瑞明， 張?zhí)m蘭*， 閆希軍

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193;2.天津天士力集團(tuán)研究院現(xiàn)代中藥所，天津300410)

大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.、唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim.ex Balf或藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根及根莖［1］，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，因其色黃而得名［2］。大黃是中醫(yī)中傳統(tǒng)的瀉劑之一，致瀉的主要成分為蒽醌類(lèi)化合物，其中以番瀉苷的作用最強(qiáng)，游離型蒽醌瀉下作用較弱。番瀉苷A和B是大黃的活性成分，韓國(guó)及日本均將番瀉苷A作為檢測(cè)指標(biāo)［3］。自古研究大黃以來(lái)，大黃有在處方中需要后下之說(shuō)，藥典用法有不宜久煎，都是因?yàn)榧訜釙r(shí)間過(guò)長(zhǎng)瀉下成分會(huì)分解［4-5］，但很少有文獻(xiàn)報(bào)道其具體成分轉(zhuǎn)化途徑，本實(shí)驗(yàn)對(duì)大黃中主要瀉下成分番瀉苷類(lèi)進(jìn)行了受熱條件下轉(zhuǎn)化關(guān)系的研究，闡述了其分解途徑，對(duì)大黃在中藥制劑中的應(yīng)用具有科學(xué)性指導(dǎo)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀 (Waters e2695 Separations Module，Waters 2998 PDA檢測(cè)器，Empower數(shù)據(jù)處理軟件)，質(zhì)譜儀 (Agilent G6300 MS TRAP)調(diào)溫電熱套 (98-1-B型)，電子分析天平 (梅特勒/XS205DU)。

1.2 試藥 大黃購(gòu)于安國(guó)藥材市場(chǎng)，為四川大黃統(tǒng)貨，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥教授鑒定為藥用大黃 Rheum officinale Baill.。

番瀉苷A、B、C、D對(duì)照品 (天津馬克生物技術(shù)有限公司，批號(hào):f-20091215)，磷酸 (天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，色譜純)，食用乙醇，二純水 (Milli-Q制備)，色譜乙腈 (Merck公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈 (A)-0.1%磷酸水溶液 (B)梯度洗脫，0～50 min(10% ～27%A)，50～55 min(27% ～27%A)，55～78 min(27% ～53%A)，78～83 min(53%～80%A)，83～93 min(80%A);柱溫35℃;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm;體積流量1.0 mL/min。

2.2 供試品溶液制備

2.2.1 大黃原液樣品制備 以最優(yōu)工藝［6］提取大黃生藥，稱(chēng)取大黃生藥20.0 g，加入10倍生藥量的80%乙醇，回流提取3次，每次提取時(shí)間為0.5 h，得大黃提取液。取樣，為0時(shí)刻待測(cè)液。分別平行取6份大黃提取液，每份200 mL置于圓底燒瓶中，回流加熱，回流時(shí)間依次為10、20、30、40、50、60 min。分別取樣平行3份，以2.1項(xiàng)色譜條件方法檢測(cè)，比較大黃中4個(gè)番瀉苷類(lèi)成分變化。

2.2.2 番瀉苷樣品制備 分別精密稱(chēng)取番瀉苷A、B、C、D各2.5 mg，用80%乙醇定容于25 mL量瓶中，得0.1 mg/mL供試品溶液。取樣，為0時(shí)刻待測(cè)液。分別將供試品溶液移置50 mL燒瓶中，電熱套加熱回流，分別在10、20、30、40、50、60 min時(shí)刻取樣，得待測(cè)液，以2.1項(xiàng)色譜條件方法檢測(cè)。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性 分別精密吸取番瀉苷A、B、C、D對(duì)照品原溶液3、5、7、9、12、15 μL，按2.1項(xiàng)色譜條件，高效液相檢測(cè)，測(cè)得峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，回歸方程分別為:YA=862384 X+421483，r=0.9995;YB=919823X －28414，r=0.9990;YC=541435X －12076，r=0.9991;YD=929651X －40147，r=0.9998。番瀉苷A、B、C、D 在0.3 μg～1.5 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取番瀉苷A、B、C、D對(duì)照品原溶液10 μL，按2.1項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得各峰面積，得其RSD值分別為0.26%、0.37%、0.45%和0.43%，表明精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 供試品溶液每時(shí)刻分別平行取樣3份，進(jìn)行測(cè)定，得番瀉苷A、B、C、D峰面積值的RSD均小于3%，表明重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取番瀉苷A、B、C、D對(duì)照品原溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，峰面積的RSD值分別為1.06%、1.27%、0.95%和1.31%，表明在常溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 結(jié)果

2.4.1 大黃提取液未加熱前HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。大黃中番瀉苷A、B、C、D成分在受熱條件下均存在降解，通過(guò)對(duì)大黃中番瀉苷A、B、C、D在受熱條件下各時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)峰面積進(jìn)行比對(duì)，分別得到1 h內(nèi)的變化趨勢(shì)，見(jiàn)圖2～5。

圖1 大黃提取液HPLC圖譜Fig.1 Chromatogram of rhubarb extract

圖2 番瀉苷A變化趨勢(shì)圖Fig.2 Changed trend chart of sennoside A

圖3 番瀉苷B變化趨勢(shì)圖Fig.3 Changed trend chart of sennoside B

圖4 番瀉苷C變化趨勢(shì)圖Fig.4 Changed trend chart of sennoside C

圖5 番瀉苷D變化趨勢(shì)圖Fig.5 Changed trend chart of sennoside D

2.4.2 番瀉苷A、B、C、D在受熱條件下存在相互轉(zhuǎn)化關(guān)系，在1 h內(nèi)呈規(guī)律性趨勢(shì)變化，結(jié)果見(jiàn)圖6～9。

圖6 番瀉苷A受熱條件下1h內(nèi)變化情況Fig.6 Sennoside A changes under heating condition in 1 h

圖7 番瀉苷B受熱條件下1 h內(nèi)變化情況Fig.7 Sennoside B changes under heating condition in 1 h

圖8 番瀉苷C受熱條件下1 h內(nèi)變化情況Fig.8 Sennoside C changes under heating condition in 1 h

番瀉苷A在1 h內(nèi)80%乙醇中加熱回流條件下，可以轉(zhuǎn)化為番瀉苷B和番瀉苷C。番瀉苷B在1 h內(nèi)80%乙醇中加熱回流條件下，可以轉(zhuǎn)化為番瀉苷A和番瀉苷C。番瀉苷C在1 h內(nèi)80%乙醇中加熱回流條件下，可以轉(zhuǎn)化為番瀉苷B和番瀉苷D和新的中間產(chǎn)物。番瀉苷D在1 h內(nèi)80%乙醇中加熱回流條件下，可以轉(zhuǎn)化為番瀉苷B和番瀉苷C和新的中間產(chǎn)物。見(jiàn)表1～4。

圖9 番瀉苷D受熱條件下1 h內(nèi)變化情況Fig.9 Sennoside D changes under heating condition in 1 h

表1 番瀉苷A在加熱回流各時(shí)間點(diǎn)的峰面積百分比Tab.1 Peak area percentage of sennoside A under heating reflux condition each time

表2 番瀉苷B在加熱回流各時(shí)間點(diǎn)的峰面積百分比Tab.2 Peak area percentage of sennoside A under heating reflux condition each time

番瀉苷A、B、C、D化學(xué)結(jié)構(gòu)式［7］見(jiàn)圖10。

番瀉苷A和B互為異構(gòu)體，相對(duì)分子質(zhì)量為862.74;番瀉苷C和D互為異構(gòu)體，相對(duì)分子質(zhì)量為848.74［8］。取番瀉苷D加熱60 min時(shí)刻的樣品，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。番瀉苷C和D加熱下有新中間產(chǎn)物生成，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜分析，對(duì)正離子碎片離子峰采集，結(jié)果如圖11，得知推測(cè)生成的中間產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量為834.7。

表3 番瀉苷C在加熱回流各時(shí)間點(diǎn)的峰面積百分比Tab.3 Peak area percentage of sennoside A under heating reflux condition each time

表4 番瀉苷D在加熱回流各時(shí)間點(diǎn)的峰面積百分比Tab.4 Peak area percentage of sennoside A under heating reflux condition each time

3 討論

大黃瀉下的有效成分為蒽醌類(lèi)衍生物，以蒽酮苷類(lèi)瀉下效力較強(qiáng)，游離蒽酮較弱，游離蒽醌更次。雙蒽酮比單蒽酮強(qiáng)，其中番瀉苷A(sennoside A)為大黃瀉下最強(qiáng)的有效成分［9］。因番瀉苷A加熱分解，大黃煎煮時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使瀉下作用減弱［10］。大黃中番瀉苷類(lèi)成分為大黃瀉下作用的主要成分［11］，藥效作用大，但含有量較少，因此有必要對(duì)番瀉苷類(lèi)單體成分進(jìn)行研究，使大黃更好的在現(xiàn)代中藥中應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)大黃中番瀉苷類(lèi)成分受熱條件下考察，番瀉苷A、B、C、D成分均有降解，為明確其降解原因，故首次將番瀉苷A、B、C、D對(duì)照品作為考察對(duì)象，更直觀的對(duì)大黃中番瀉苷類(lèi)成分穩(wěn)定性進(jìn)行研究，揭示了番瀉苷類(lèi)成分之間的轉(zhuǎn)化關(guān)系，避免了大黃中其他成分對(duì)番瀉苷類(lèi)成分研究時(shí)的影響。

大黃藥材中番瀉苷總量在0.304%～1.450%之間，均值在0.892%［12］，其中含番瀉苷D較低，同時(shí)，從單體番瀉苷D受熱下轉(zhuǎn)化情況得知其降解率大，且轉(zhuǎn)化中難形成番瀉苷D，推測(cè)為大黃中番瀉苷D受熱全部降解的原因，HPLC未能檢測(cè)出。

圖10 番瀉苷A、B、C、D化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.10 Chemical structures of sennoside A，B，C，D

圖11 中間產(chǎn)物質(zhì)譜圖譜Fig.11 Mass spectrum of intermediate product

結(jié)合型蒽醌以番瀉苷為主，是大黃蒽醌類(lèi)衍生物以及蒽酮與葡萄糖結(jié)合形成的苷類(lèi)。蒽酮糖苷進(jìn)行治療時(shí)發(fā)揮作用的成分為水解后苷元的部分［13］。大黃中番瀉苷類(lèi)成分的致瀉作用是因其在腸內(nèi)變?yōu)榇簏S酸蒽酮所致，并進(jìn)一步被氧化成番瀉苷元［7，14］。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，二蒽酮番瀉苷類(lèi)成分在受熱條件下可斷鏈形成單蒽酮，又可再結(jié)合，形成互相轉(zhuǎn)化過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)考察番瀉苷類(lèi)成分是為大黃更好的應(yīng)用為前提，大黃提取醇提法也為經(jīng)典法［15］，故只考慮了80%醇中和受熱條件下其轉(zhuǎn)化關(guān)系。對(duì)于番瀉苷類(lèi)成分在不同溶媒及不同pH和不同溫度條件下的變化關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。

實(shí)驗(yàn)中，在質(zhì)譜分析中，番瀉苷D在加熱條件下生成的新中間產(chǎn)物量較大，所以選擇其加熱60 min時(shí)刻進(jìn)行分析。番瀉苷A和B的相對(duì)分子質(zhì)量已知為862.74，番瀉苷C和D的相對(duì)分子質(zhì)量為848.74，故通過(guò)質(zhì)譜正離子譜圖得其中間產(chǎn)物分子量。

該實(shí)驗(yàn)對(duì)大黃中4個(gè)番瀉苷類(lèi)成分的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，數(shù)據(jù)真實(shí)可靠，為大黃在中藥現(xiàn)代化中的應(yīng)用提供可靠性指導(dǎo)。

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