朱谷晶， 鄭杭生， 王肖龍， 陶建生

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海201203;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州310053;3.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海201203)

青藤堿 (sinomenine，Sin)系從防己科植物青風(fēng)藤 Sinomenium acutum(Thunb.)Rehd.et wils.及毛青藤 Sinomenium acutum(Thunb.)Rehd.et wils.var.cinereum(Diels)Reht.et Wils的根莖提取，藥用多為鹽酸青藤堿 (sinomenine hydrochloride)，分子式為C9H2304·HCl，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，它具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑制免疫、降壓及抗心率失常等作用［1］，目前臨床主要用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，其口服不良反應(yīng)較多［2］，且生物半衰期較短［3］，需頻繁給藥［4］，故有必要進(jìn)行新劑型與新給藥途徑的研究以彌補(bǔ)上述缺點(diǎn)。鹽酸青藤堿外用制劑通過(guò)透皮吸收，在起到袪風(fēng)通絡(luò)、散寒除濕、止痛消炎作用的同時(shí)，可以避免肝臟和胃腸道對(duì)藥物的破壞，降低藥物的毒副反應(yīng)，且給藥方便。皮膚外用制劑應(yīng)用后皮膚中的藥物含有量的監(jiān)測(cè)對(duì)于闡明制劑的起效時(shí)間、作用持續(xù)時(shí)間以及藥物經(jīng)皮滲透機(jī)制有重要意義，故本實(shí)驗(yàn)建立了一種高效液相色譜法用于測(cè)定皮膚中青藤堿，方法快速、精密、準(zhǔn)確。

圖1 鹽酸青藤堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of sinomenine hydrochloride

1 儀器和材料

1.1 儀器 LC-2130高效液相色譜儀 (上海天美公司);低速離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器公司);BS124 S電子天平 (德國(guó)薩多利斯公司)。

1.2 材料 青藤堿對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):0774-200206);鹽酸昂丹司瓊 (ondansetron hydrochloride，Ond-HCl)(純度99.9%，浙江黃巖延年制藥廠，批號(hào):011213);青藤堿傳遞體混懸液 (自制，處方主要輔料包括大豆磷脂、膽固醇、維生素E與脫氧膽酸鈉);甲醇為色譜純;HPLC用水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量 (200±20)g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證號(hào)SCXK(滬)2007-0005。

2 分析方法的建立

2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)取青藤堿對(duì)照品5.05 mg，用流動(dòng)相溶解，配制成0.202 mg/mL的對(duì)照品溶液，4℃保存。

2.2 色譜條件 C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm，Kromasil);流動(dòng)相為甲醇-水-乙二胺(55∶45∶0.225)混合液;體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm;柱溫30℃;定量環(huán)定量進(jìn)樣20 μL。

2.3 鼠皮的制備 取正常進(jìn)食可自由飲水的未給藥大鼠，過(guò)量乙醚麻醉致死，剔除腹部的毛并取下該部位的皮膚。將取下的皮膚平鋪于玻璃板上，角質(zhì)層朝下，除去皮下組織，用生理鹽水沖洗干凈，將皮膚展平后置于兩玻璃板之間，加少量生理鹽水浸潤(rùn)皮膚，最后置于自封袋中，密閉放于冰箱(－40℃)中保存，備用。

2.4 堿化液的配制 精密稱(chēng)取1.060 g碳酸鈉，溶解于100 mL純凈水中，標(biāo)記為A溶液，精密稱(chēng)取0.840 g碳酸氫鈉，溶解于100 mL純凈水中，標(biāo)記為 B溶液，取 A溶液 87.9 mL，B溶液12.1 mL，混合，即得碳酸鹽緩沖溶液，測(cè)得pH=10.84，常溫下保存。

2.5 空白皮膚樣品處理 空白皮膚樣品的處理與分析主要用于考察分析方法的專(zhuān)屬性、線(xiàn)性關(guān)系、精密度、準(zhǔn)確度與樣品穩(wěn)定性等。取空白皮膚樣品，在室溫下自然解凍，剪取1 cm2，置于研磨器中，加入200 μL碳酸鹽緩沖液 (pH=10.84)，根據(jù)需要加入200 μL內(nèi)標(biāo)物鹽酸昂丹司瓊?cè)芤?19.6 μg/mL，水溶液)，充分研磨，得皮膚勻漿。加入3 mL提取溶劑正己烷－二氯甲烷－異丙醇(100∶50∶5)混合液［4］，渦旋1 min，3000 r/min離心5 min后將上清液轉(zhuǎn)移至5 mL具塞塑料離心管中，于50℃下氮?dú)饬鞔蹈?。殘留物?50 μL流動(dòng)相溶解，渦旋30 s，離心后吸取20 μL上清液進(jìn)樣分析。按考察項(xiàng)目要求記錄色譜圖，處理數(shù)據(jù)。

2.6 含藥皮膚樣品測(cè)定 將青藤堿傳遞體混懸液施用于大鼠皮膚，一定時(shí)間后取下施藥部位皮膚即得含藥皮膚樣品。取皮膚樣品，剪取合適大小，并量取尺寸，計(jì)算面積，如不足1 cm2，則以空白皮膚補(bǔ)足，置于研磨器中，加入200 μL碳酸鹽緩沖液 (pH=10.84)與200 μL內(nèi)標(biāo)物鹽酸昂丹司瓊?cè)芤?(19.6 μg/mL，水溶液)，充分研磨，得皮膚勻漿。提取與進(jìn)樣分析過(guò)程同2.5項(xiàng)下，將青藤堿與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，即得皮膚樣品中青藤堿的總量，此結(jié)果再除以皮膚樣品面積即得單位面積皮膚中的量。

2.7 分析方法確證

2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制 取空白皮膚1 cm2，置于研磨器，分別加入0.202 mg/mL的青藤堿對(duì)照品溶液5、10、25、50、75、100 μL(其中青藤堿對(duì)照品的量分別為 1.02、2.04、5.10、10.2、15.3、20.4 μg)之后按2.5項(xiàng)下操作，從“加入200 μL碳酸鹽緩沖液”至“進(jìn)樣分析”，記錄色譜圖。以青藤堿與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比y對(duì)相應(yīng)的青藤堿對(duì)照品的量x(μg)作圖，得線(xiàn)性回歸方程為:y=0.0767x－0.0081，R =0.9983，線(xiàn)性范圍為1.02～20.4 μg(青藤堿對(duì)照品的量)。

2.7.2 方法專(zhuān)屬性試驗(yàn) 制備以下4個(gè)皮膚樣品:(1)空白皮膚1 cm2;(2)空白皮膚1 cm2加200 μL內(nèi)標(biāo)物溶液 (19.6 μg/mL，水溶液);(3)空白皮膚1 cm2加50 μL青藤堿對(duì)照品溶液;(4)0.2 mL青藤堿傳遞體混懸液 (相當(dāng)于青藤堿1.3 mg)應(yīng)用12 h后的皮膚樣品。按2.5項(xiàng)下操作從“加入200 μL碳酸鹽緩沖液”至“進(jìn)樣分析”，各樣品的色譜圖見(jiàn)圖2，由圖可見(jiàn)，皮膚中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定，內(nèi)標(biāo)物出峰時(shí)間合適并與青藤堿的色譜峰完全分離。

2.7.3 方法的精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取空白皮膚1 cm2，加入不同體積青藤堿對(duì)照品溶液制備低、中、高含有量 (2.04 μg、10.2 μg、20.4 μg)的質(zhì)量控制 (quality controll，QC)樣品 (5樣本)，按2.5項(xiàng)下方法從“加入200 μL碳酸鹽緩沖液”預(yù)處理至“進(jìn)樣分析”，連續(xù)測(cè)定5 d，分別計(jì)算日內(nèi)與日間不同含有量下青藤堿與內(nèi)標(biāo)物峰面積比的RSD，即為日內(nèi)與日間精密度，結(jié)果表明，低、中、高樣品的日內(nèi)精密度為 5.9%、7.2%、6.5%，日間精密度為4.3%、5.0%、0.8%，方法的精密度良好。將QC樣品中測(cè)得青藤堿的量(代入回歸曲線(xiàn)方程計(jì)算得到)與配制溶液時(shí)加入青藤堿的量相對(duì)照 (計(jì)算相對(duì)回收率)，求得本法的準(zhǔn)確度［5］，結(jié)果表明，低、中、高樣品的相對(duì)回收率為92.6% ～104.6%，RSD為2.2% ～3.0%，方法的準(zhǔn)確度良好。

圖2 青藤堿與內(nèi)標(biāo)物鹽酸昂丹司瓊的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of sinomenine and the internal standard ondansetron hydrochloride

2.7.4 提取回收率試驗(yàn) 取空白皮膚1 cm2，加入不同體積青藤堿對(duì)照品溶液制備低、中、高含有量(2.04 μg、10.2 μg、20.4 μg)的 QC 樣品，每個(gè)含有量下進(jìn)行3樣本分析，按2.5項(xiàng)下方法預(yù)處理至“進(jìn)樣分析”，記錄峰面積。另取空白皮膚1 cm2，按2.5項(xiàng)下方法從“加入200 μL碳酸鹽緩沖液”預(yù)處理至“轉(zhuǎn)移至5 mL具塞塑料離心管中”，得到的有機(jī)層中加入相對(duì)應(yīng)的不同體積的對(duì)照品溶液，于50℃下氮?dú)饬鞔蹈?，殘留物?50 μL流動(dòng)相溶解，渦旋30 s，離心后吸取20 μL上清液進(jìn)樣分析，得到相應(yīng)峰面積值，每個(gè)含有量下平行測(cè)定3份。以每一青藤堿對(duì)照品加入量?jī)煞N處理方法的峰面積比值計(jì)算提取回收率［5］。結(jié)果表明，低、中、高含有量樣品的提取回收率為73.9%～87.9%，符合生物樣本定量測(cè)定提取回收率的要求。同法測(cè)定內(nèi)標(biāo)物鹽酸昂丹司瓊的提取回收率(考察一個(gè)加樣量200 μL ×19.6 μg/mL)，結(jié)果表明，內(nèi)標(biāo)物鹽酸昂丹司瓊的提取回收率為80.1%～86.6%，符合要求。

2.7.5 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 取空白皮膚1 cm2，加入不同體積青藤堿對(duì)照品溶液 (對(duì)應(yīng)青藤堿對(duì)照品的量分別為 2.04 μg、10.2 μg、20.4 μg)，制成QC樣品，按2.5項(xiàng)下方法從“加入200 μL碳酸鹽緩沖液”預(yù)處理至“殘留物用150 μL流動(dòng)相溶解”，室溫下放置24 h測(cè)定，以考察處理后的青藤堿皮膚樣品在室溫下的穩(wěn)定性［5］。同法配制不同青藤堿含有量的QC樣品，經(jīng)反復(fù)3次－20℃冷凍，室溫解凍后，測(cè)定樣品，以考察樣品在冷凍和解凍過(guò)程中的穩(wěn)定性［5］。每一含藥量進(jìn)行3樣本分析。穩(wěn)定性以皮膚樣品中青藤堿的測(cè)得量與加入量之間的相對(duì)回收率表示。結(jié)果見(jiàn)表1，低、中、高含有量樣品，復(fù)溶后的供試品溶液在室溫下放置24 h，相對(duì)回收率分別為 97.9%、111.5%、104.0%，表明24 h內(nèi)復(fù)溶的供試品溶液穩(wěn)定;皮膚樣品冷凍-解凍循環(huán)3次相對(duì)回收率分別為96.0%、102.8%、107.4%，表明皮膚樣品冷凍-解凍循環(huán)3次基本穩(wěn)定。

表1 樣品穩(wěn)定性Tab.1 Results of the stability experiments

2.8 皮膚中藥物測(cè)定 取正常進(jìn)食可自由飲水的健康雄性SD大鼠3只，適量乙醚麻醉后固定于鼠板，剔除腹部的毛并將0.2 mL青藤堿傳遞體混懸液 (相當(dāng)于青藤堿1.3 mg)均勻的涂布于2 cm2的皮膚范圍內(nèi)，12 h后用過(guò)量乙醚使大鼠麻醉致死，同2.3項(xiàng)下取下施藥部位的皮膚，用蒸餾水沖洗皮膚以去除表面吸附的藥物，按2.6項(xiàng)下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，3只大鼠的測(cè)定皮膚中藥物的含有量分別為 33.08、38.53、31.21 μg/cm2。

3 結(jié)論與討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)建立了一種大鼠皮膚中青藤堿測(cè)定的HPLC方法，采用內(nèi)標(biāo)法，在青藤堿的HPLC測(cè)定中本實(shí)驗(yàn)首次采用鹽酸昂丹司瓊 (Ond-HCl)作為內(nèi)標(biāo)物，內(nèi)標(biāo)物的峰可與內(nèi)源性成分和青藤堿實(shí)現(xiàn)基線(xiàn)分離，與咖啡因作內(nèi)標(biāo)相比，可以縮短分析時(shí)間［6］。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證表明:皮膚中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定無(wú)干擾;測(cè)定取樣皮膚中青藤堿含有量在1.02～20.4 μg的范圍內(nèi)與藥物峰面積和內(nèi)標(biāo)物峰面積之比呈良好的線(xiàn)性關(guān)系;方法精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率、穩(wěn)定性均符合生物樣品分析要求。有關(guān)青藤堿在生物樣品血清、血漿與尿液中的分析測(cè)定均已有文獻(xiàn)報(bào)道［7-9］，但在皮膚樣品中的測(cè)定未見(jiàn)報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了相關(guān)的研究。

3.2 因?yàn)槠つw為一個(gè)比較特殊的生物樣本，其中藥物濃度與其表面是否施藥有直接關(guān)系，所以藥物皮膚應(yīng)用后關(guān)注的也是施藥范圍內(nèi)皮膚的藥物濃度。皮膚中藥物濃度該如何表示呢?本課題組認(rèn)為質(zhì)量/質(zhì)量分?jǐn)?shù)或質(zhì)量/體積分?jǐn)?shù)不太適合表示皮膚中的藥物濃度，因?yàn)樗幬镌谑┧幤つw中的縱向分布(角質(zhì)層→活性表皮→真皮層→皮下組織)是不均勻的，多數(shù)藥物主要是分布在表皮，尤其是角質(zhì)層中，形成藥物儲(chǔ)庫(kù)［10］，同時(shí)，制備皮膚樣品時(shí)涉及到去除皮下組織的操作，這個(gè)操作中皮下組織去多去少對(duì)質(zhì)量/質(zhì)量分?jǐn)?shù)或質(zhì)量/體積分?jǐn)?shù)表示的濃度會(huì)有較大影響，所以采用單位面積皮膚中藥物的量 (質(zhì)量/面積分?jǐn)?shù))來(lái)表示皮膚中藥物的濃度，這樣可以避免皮膚樣品制備上厚度不一致對(duì)結(jié)果造成的影響。

3.3 根據(jù)文獻(xiàn)［11-13］考察了甲醇-水-乙二胺(55∶45∶0.225)混合液，甲醇-0.005 mol/L磷酸氫二鈉水溶液 (55∶45)混合液，乙腈-水 (14∶86)混合液3種流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為甲醇-水-乙二胺 (55∶45∶0.225)混合液時(shí)，青藤堿及內(nèi)標(biāo)物色譜峰峰形均較好，不拖尾，保留時(shí)間適宜，鼠皮內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)干擾，所以選擇此流動(dòng)相系統(tǒng)。

3.4 鹽酸青藤堿對(duì)溫度不穩(wěn)定、受熱易氧化變黃［14］，故本實(shí)驗(yàn)在皮膚樣品的前處理中采用研磨勻漿，為一種物理方法，與具有強(qiáng)烈腐蝕性與氧化性的化學(xué)物質(zhì) (如高氯酸)處理法相比，有利于藥物的穩(wěn)定。

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