林 林， 劉廣楨， 尹寧寧

(山東省食品藥品檢驗(yàn)所，山東濟(jì)南250101)

金匱腎氣丸源于《金匱要略》，在古方的基礎(chǔ)上，經(jīng)過加味牛膝、車前子后形成今方的金匱腎氣丸，具有溫補(bǔ)腎陽(yáng)，化氣行水。用于腎虛水腫，腰膝酸軟，小便不利，畏寒肢冷等癥?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第二十冊(cè)［1］，僅收載有牛膝的薄層鑒別項(xiàng)，無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)。本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)中馬錢苷［2-5］、丹皮酚［6-8］、毛蕊花糖苷［9-11］和芍藥苷［12-14］的定量測(cè)定方法，增加了處方中山茱萸、牡丹皮、車前子、地黃等藥味有效成分馬錢苷、丹皮酚、芍藥苷、毛蕊花糖苷的定量測(cè)定。通過方法學(xué)驗(yàn)證，該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，有利于對(duì)金匱腎氣丸進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1 儀器與試藥

Waters2765-2998高效液相色譜儀，Waters色譜工作站，Mettler AE240電子天平 (瑞士梅特勒公司);馬錢苷 (批號(hào):111640-200604)，芍藥苷(批號(hào):110736-200833)，毛蕊花糖苷 (批號(hào):111530-200706)， 丹 皮 酚 (批 號(hào):110708-200505)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;乙腈為色譜純;甲醇、磷酸為分析純。金匱腎氣丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號(hào):1035901;北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號(hào):1035904;山東大陸藥業(yè)有限公司，批號(hào):110512)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Thermo Hypersil BDS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);以乙腈為流動(dòng)相A，0.01%磷酸為流動(dòng)相B，按梯度洗脫 (見表1);體積流量1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)0～17 min，237 nm;18～25 min，233 nm;25～40 min，330 nm;40～55 min，275 nm。柱溫35℃。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取馬錢苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚對(duì)照品適量，加80%甲醇制成質(zhì)量濃度為37.82、53.52、76.51、64.70 μg/mL的混合溶液，作為混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取供試品適量，研細(xì)，取2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

表1 梯度洗脫順序Tab.1 Gradient elution mode of mobile phase

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取不加山茱萸的陰性樣品、不加牡丹皮的陰性樣品、不加車前子和地黃的陰性樣品按供試品溶液的制備項(xiàng)下的方法，分別制得缺山茱萸陰性對(duì)照溶液、缺牡丹皮陰性對(duì)照溶液和缺地黃、車前子陰性對(duì)照溶液。

2.5 方法的專屬性考察 取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明馬錢苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚分離度良好，陰性無(wú)干擾。見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品溶液2、5、10、15、25 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。由進(jìn)樣量 (C)對(duì)峰面積 (A)求得工作曲線，得到回歸方程。馬錢苷:A=1783751.40C－2635.78，r=0.9997，線性范圍:0.0756 ～0.9455 μg。芍藥苷:A=893557.46C－1335.73，r=0.9999，線性范圍:0.1070～1.3381 μg。毛蕊花糖苷:A=1020214.99C+2766，r=0.9998，線性范圍:0.1530 ～1.9127 μg。丹皮酚:A=5307383.59C+4106.68，r=1.0000，線性范圍:0.1294～1.6175 μg。結(jié)果表明馬錢苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚在上述范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn) 取同一批金匱腎氣丸 (批號(hào)1035904)供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積積分值。計(jì)算得馬錢苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚的RSD值分別為0.86%、1.24%、0.67%、0.21%。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液分別于0、3、6、9、12、15 h測(cè)定，結(jié)果馬錢苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚的 RSD值分別為0.68%、1.27%、0.81%、0.19%。結(jié)果表明供試品溶液在15 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 缺山茱萸陰性對(duì)照樣品 (A)、缺牡丹皮陰性對(duì)照樣品 (B)、缺地黃、車前子陰性對(duì)照樣品 (C)混合對(duì)照品 (D)和金匱腎氣丸樣品 (E)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of negative sample without Corni Fructus(A)，negative sample without Moutan Cortex(B)，negative sample without Plantaginis Semen and Rehamnniae Radix(C)，mixed reference substances(D)and Jinkui Shenqi Pills(E)

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批金匱腎氣丸 (批號(hào)1035904)，按照供試品溶液的制備方法，平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算，結(jié)果馬錢苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2782 mg/g，RSD為0.81%;芍藥苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5873 mg/g，RSD為1.61%;毛蕊花糖苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7426 mg/g，RSD為0.59%;丹皮酚平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7440 mg/g，RSD為0.48%。結(jié)果表明本方法的重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收試驗(yàn) 取金匱腎氣丸 (批號(hào)1035904)適量，精密稱取6份，每份1.0 g(約相當(dāng)于馬錢苷0.2782 mg、芍藥苷0.5873 mg、毛蕊花糖苷0.7426 mg、丹皮酚0.7440 mg)，置具塞錐形瓶中，分別精密加入對(duì)照品溶液10 mL(馬錢苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚質(zhì)量濃度分別為0.02715 mg/mL、0.05884 mg/mL、0.07294 mg/mL、0.07314 mg/mL)，再精密加入80%甲醇40 mL，按供試品溶液制備方法進(jìn)行制備并測(cè)定。結(jié)果表明該方法的回收率良好。結(jié)果見表2～5。

2.11 樣品的測(cè)定 取不同廠家金匱腎氣丸樣品3批，進(jìn)行含有量測(cè)定。結(jié)果見表6。

表2 馬錢苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery test of loganin

表3 芍藥苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of recovery tests of paeoniflorin

3 討論

3.1 提取溶媒的選擇 分別以甲醇、80%甲醇、50%甲醇為提取溶劑，超聲處理30 min，進(jìn)行提取，結(jié)果以80%甲醇提取效率最高，故選擇80%甲醇為提取溶媒。

表4 毛蕊花糖苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of recovery tests of verbascoside

表5 丹皮酚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of recovery tests of paeonol

表6 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.6 Determination results of samples(n=3)

3.2 提取方法的選擇 以80%甲醇為溶媒，分別進(jìn)行超聲15 min、30 min、60 min;加熱回流1 h、2 h考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加熱回流會(huì)導(dǎo)致丹皮酚含量降低，超聲30 min和60 min效果相當(dāng)，故提取方法確定為超聲處理30 min進(jìn)行提取。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 由于所用液相的檢測(cè)器為紫外二極管檢測(cè)器，設(shè)定波長(zhǎng)范圍210～400 nm進(jìn)行掃描，結(jié)果馬錢苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚分別在237 nm、233 nm、330 nm、275 nm波長(zhǎng)處吸收最大，因此采用波長(zhǎng)切換法進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為:0～17 min，237 nm;18～25 min，233 nm;25 ～ 40 min，330 nm;40 ～ 55 min，275 nm。

［1］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(中藥)(衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第二十冊(cè))［S］.1998:191.

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