楊萬軍， 張偉東， 王 瑩， 王 青， 顧 宜， 王 榮， 王曉娟

(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院藥劑科，陜西西安710032)

中藥射干為鳶尾科射干屬植物射干Belamcanda chinensis(L.)D C.的干燥根莖。射干的藥理作用明顯，具有清熱解毒、利咽消痰、散瘀消腫的功效［1］，主要用于治療流感及上呼吸道感染［2］。臨床上常與其他藥物配伍使用，如與麻黃配伍治療支氣管哮喘，其療效已為大量臨床應(yīng)用所證實(shí)［3-5］。射干中含有豐富的異黃酮類成分，實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)其具有顯著的抗炎、祛痰平喘、抗病毒、抑菌作用［6-9］，本課題在藥效試驗(yàn) (文章另發(fā))基礎(chǔ)上，通過比較射干提取物與麻黃提取物配伍前后大鼠體內(nèi)射干異黃酮類成分射干苷元、野鳶尾黃素、次野鳶尾黃素 (結(jié)構(gòu)見圖1)的藥代動(dòng)力學(xué)，揭示麻黃與射干配伍后射干異黃酮類成分在大鼠體內(nèi)的變化規(guī)律，為射干、麻黃配伍提供現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)。

1 試藥與儀器

1.1 藥品與試劑 射干苷元 (Tectorigenin)、野鳶尾黃素 (Irigenin)、次野鳶尾黃素 (Irisforentin)分別由本實(shí)驗(yàn)室分離獲得，純度＞98.0%;山柰酚(Kaempferol，批號(hào)1124S，購(gòu)自北京恒元啟天化工院);甲醇、乙腈 (色譜純，德國(guó)Merck公司);甲酸 (色譜純，美國(guó)Agilent);Mili-Q超純水。β-葡萄糖醛酸酶 (規(guī)格1240000U/G，批號(hào) G0251，美國(guó)SIGMA公司)。

1.2 儀器 6460型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 (美國(guó)Agilent technology公司)，配有電噴霧離子源(ESI)及 MassHunter VersionB.04.10工作軟件;Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜系統(tǒng)，含G4220A二元泵、G1314E VWD檢測(cè)器、G1316C柱溫箱及G4226A自動(dòng)進(jìn)樣器。

圖1 3個(gè)黃酮類成分及內(nèi)標(biāo)山柰酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of three isoflavonids and IS(kaempferol)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18柱 (2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，Agilent在線過濾器;以乙腈(ACN)-水 (含0.1%甲酸FA)為流動(dòng)相梯度洗脫 (洗脫梯度見表1)，柱溫30℃，進(jìn)樣量5 μL。

表1 流動(dòng)相洗脫梯度Tab.1 Mobile phase gradients

2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離源 (ESI);掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式 (MRM);噴霧氣壓為310.275 kPa，霧化器溫度為350℃;毛細(xì)管電壓為正離子4 kV，負(fù)離子3.5 kV;氣流速度10 L/min。掃描時(shí)間為13 min。用于定量分析的離子反應(yīng)及質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 定量離子及質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 Isoflavonids MRM transitions

2.3 溶液的配制

2.3.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取鳶尾苷元41.08 mg、野鳶尾黃素44.64 mg、次野鳶尾黃素44.64 mg，用甲醇溶解定容至10 mL量瓶中，配成質(zhì)量濃度分別為4.108、4.464、4.464 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，4℃保存。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)藥品的配制 準(zhǔn)確稱取射干浸膏1 g 2份，其中一份加入1 g麻黃浸膏，分別用0.1%CMC-Na溶液20 mL溶解混勻，配成50 mg/mL的射干浸膏溶液和藥對(duì)溶液。

2.3.3 β-葡萄糖醛酸酶的配制 稱取28.39 mg β-葡萄糖醛酸酶，乙酸銨溶液 (pH4.7)溶解定容至100 mL量瓶中 (合3520 U/mL)，保存于－20℃冰箱中。整個(gè)操作須于冰面上進(jìn)行。

2.4 給藥方案與樣品采集 雄性Sprague-Dawley大鼠12只，體質(zhì)量 (200±15)g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(軍2009027)，給藥前禁食12 h，隨機(jī)分為兩組:射干組灌胃給予射干浸膏溶液2.5 mL/只，藥對(duì)組給予藥對(duì)溶液2.5 mL/只 (經(jīng)測(cè)定，合給藥劑量射干苷元31.6 mg/kg，野鳶尾黃素8.5 mg/kg，次野鳶尾黃素14.6 mg/kg)。給藥后0、5、10、15、30 min和1、2、3、5、8、12、24 h自眼底靜脈取血0.3 mL置肝素化的EP管中，室溫靜置約30 min后3000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上層血漿貯存于－20℃。

2.5 樣品處理 50 μL血漿中加入50 μL β-葡萄糖醛酸酶渦旋混勻，37.5℃水浴搖床孵育5 h，加1 μL山柰酚內(nèi)標(biāo)溶液 (10 ng/mL)渦旋1 min，2 mL乙酸乙酯萃取兩次，12000 r/min離心10 min，上清液45℃氮?dú)獯蹈桑?00 μL甲醇復(fù)溶，過0.22 μm濾膜進(jìn)樣測(cè)定。

2.6 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用DAS 2.0藥代動(dòng)力學(xué)軟件求出藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，采用SPSS 13.0軟件中Wilcoxon秩和檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)對(duì)各組的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析。

2.7 測(cè)定方法的建立

2.7.1 方法的專屬性 空白血漿、空白血漿加分析物標(biāo)準(zhǔn)品及給藥后的血漿樣品色譜圖見圖2。結(jié)果顯示，空白血漿在與對(duì)照品對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處沒有色譜峰，3個(gè)成分及內(nèi)標(biāo)均達(dá)到基線分離，說明血漿內(nèi)源性物質(zhì)、代謝產(chǎn)物及其他成分均不干擾3個(gè)目標(biāo)成分的檢出。

圖2 空白血漿 (A)、加有對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物的血漿 (B)和大鼠灌胃給藥后的血漿(C)色譜圖Fig.2 Typical chromatograms of blank plasma(A)，spiked plasma with targets and the IS(B)，and the plasma from rats after administration(C)

2.7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)靈敏度 取混合對(duì)照品用甲醇按1∶10逐級(jí)倍量稀釋得不同質(zhì)量濃度的系列對(duì)照品，分別取100 μL空白血漿和100 μL山柰酚內(nèi)標(biāo)液對(duì)應(yīng)稀釋，按樣品處理項(xiàng)下的方法進(jìn)行處理，得終質(zhì)量濃度分別為射干苷元2.054～410.8 ng/mL，野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素2.232～446.4 ng/mL的標(biāo)曲樣品，進(jìn)樣測(cè)定后以目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比Y對(duì)目標(biāo)物質(zhì)量濃度C作圖。結(jié)果見表3。3個(gè)成分的定量下限 (LLOQ)分別為2.054、2.232、2.232 ng/mL。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍Tab.3 Calibration curves and dynamic range

2.7.3 準(zhǔn)確度與精密度 用空白血漿配制高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品各5份，測(cè)得峰面積后帶入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的藥物質(zhì)量濃度，與理論值相比，計(jì)算方法的準(zhǔn)確度;同一質(zhì)量濃度每隔2 h測(cè)定1次，測(cè)定3次，計(jì)算日內(nèi)精密度;每隔1 d測(cè)定1次，測(cè)定3次，測(cè)定日間精密度。結(jié)果見表4。日內(nèi)和日間精密度RSD值均小于9%，準(zhǔn)確度在93.4%～98.1%之間。

2.7.4 提取回收率 用空白血漿配制高、中、低3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品各5份，按樣品處理項(xiàng)下的方法進(jìn)行處理。測(cè)得峰面積后與同濃度對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣所得峰面積進(jìn)行比較，計(jì)算提取回收率。結(jié)果見表5。結(jié)果顯示高中低質(zhì)控樣品有著一致的回收率。

表4 準(zhǔn)確度與精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)Tab.4 Results of accuracy and precision(n=5)

表5 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=5)Tab.5 Results of recoveries(n=5)

2.7.5 樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的空白血漿樣品各5份，貯存于－20℃冰箱中，反復(fù)凍融3次，每次間隔24 h，按樣品處理項(xiàng)下的方法進(jìn)行處理后進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得實(shí)際值均在理論值的92.3% ～98.3%范圍波動(dòng)，RSD＜8.7%。表明樣品可以耐受3次凍融。低、中、高質(zhì)量濃度空白血漿樣品室溫放置24 h，在－20℃冰箱中放置15日，或經(jīng)處理后在自動(dòng)進(jìn)樣器中放置24 h后測(cè)定均未見明顯下降，表明該3種成分在血漿樣品中穩(wěn)定性良好。

2.7.6 基質(zhì)效應(yīng) 用流動(dòng)相分別配制含山柰酚內(nèi)標(biāo)液 (均為10 ng/mL)和射干苷元、野鳶尾黃素、次野鳶尾黃素的高 (328.64、357.12、357.12 ng/mL)、中 (41.08、44.64、44.64 ng/mL)、低(4.108、4.464、4.464 ng/mL)質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液;另取6份不同來源的大鼠空白血漿樣品，按樣品處理項(xiàng)下的方法提取，制得與上述標(biāo)準(zhǔn)品相同系列濃度的待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物溶液，分別測(cè)得血漿基質(zhì)樣品和相應(yīng)濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液中待測(cè)組分及內(nèi)標(biāo)物的峰面積，并計(jì)算其峰面積比，結(jié)果其比值均在86.23%～92.71%之間，表明大鼠血漿生物基質(zhì)不影響樣品測(cè)定。

2.8 大鼠給藥后的藥代動(dòng)力學(xué) 應(yīng)用建立的LC/MS方法，測(cè)定大鼠血漿藥物質(zhì)量濃度，各時(shí)間點(diǎn)平均藥－時(shí)曲線見圖3。各組藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表6。與射干單獨(dú)組相比，配伍后射干苷元的t1/2顯著延長(zhǎng)，表明配伍使得射干苷元的消除變慢;3個(gè)成分的AUC(0→t)均顯著增加，提示配伍后促進(jìn)了目標(biāo)成分吸收進(jìn)入體循環(huán);野鳶尾黃素、次野鳶尾黃素的Cmax顯著增加;射干苷元及次野鳶尾黃素CLz/F明顯降低，體內(nèi)清除過程變緩;次野鳶尾黃素Vz/F顯著降低;其余參數(shù)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖3 兩組大鼠灌胃給藥后的平均藥時(shí)曲線(n=5)Fig.3 Plasma concentration-time profiles of isoflavonids in rat plasma(n=5)

表6 大鼠灌胃給予50 mg/kg射干浸膏及藥對(duì)浸膏后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6)Tab.6 Mean pharmacokinetics parameters of the three isoflavonids after oral administration of extracts(n=6)

3 討論

葡萄糖醛酸化是單羥基或多羥基黃酮的主要代謝通路，口服給藥后，黃酮苷類在腸道菌群的作用下水解為苷元，進(jìn)入體循環(huán)，又在UDPG-葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)化為葡萄糖醛酸結(jié)合物或苷的形式排出體外［10-12］。因此本實(shí)驗(yàn)加入了葡萄糖醛酸酶對(duì)樣品進(jìn)行水解，所得到的結(jié)果為總苷元。結(jié)果顯示，3個(gè)檢測(cè)成分在5 min時(shí)即可檢測(cè)到且達(dá)峰時(shí)間均在0～0.5 h內(nèi)，提示這3種成分在胃部被很快吸收入血;藥時(shí)曲線呈現(xiàn)雙峰，提示這3種成分在吸收過程中可能存在腸-肝循環(huán)、腸-腸循環(huán)或胃-腸循環(huán)。配伍后射干3種異黃酮苷元成分的t1/2、AUC(0－t)等藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)發(fā)生顯著了變化，提示麻黃與射干配伍后在大鼠體內(nèi)產(chǎn)生了藥代動(dòng)力學(xué)的相互影響，其發(fā)生作用的環(huán)節(jié)是否影響藥物代謝酶、腸道菌群或者是產(chǎn)生了相互的物理化學(xué)作用，尚需進(jìn)一步深入研究。配伍使得射干異黃酮成分的作用更為持久，一定程度上驗(yàn)證了射干-麻黃這一經(jīng)典藥對(duì)配伍的科學(xué)性。

前期本課題組考察了射干單用與射干麻黃藥對(duì)配伍使用治療小鼠支氣管哮喘的藥效學(xué)差異 (實(shí)驗(yàn)結(jié)果另行發(fā)表)，結(jié)果配伍優(yōu)于射干單獨(dú)使用。配伍導(dǎo)致的藥代動(dòng)力學(xué)差異可能是其產(chǎn)生藥效學(xué)差異的原因之一。

本實(shí)驗(yàn)建立了快速靈敏的檢測(cè)3種射干異黃酮成分的UHPLC-MS/MS方法，可為進(jìn)一步研究有關(guān)射干的藥代動(dòng)力學(xué)或定量檢測(cè)提供參考。

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