趙生環(huán)，范 紅，宋正己，湯 敏

昆明醫(yī)學院附屬昆華醫(yī)院·云南省第一人民醫(yī)院消化內科，云南昆明650032

內毒素血癥在肝硬化的發(fā)生、發(fā)展及轉歸過程中具有重要的病理生理意義。其發(fā)生機制相當復雜，尚未完全明了，國內外均有研究表明，肝硬化時小腸黏膜屏障功能受損及腸道通透性可明顯增高，導致腸道內革蘭氏陰性菌產生的內毒素容易進入循環(huán)系統(tǒng)，引起腸源性內毒素血癥，本研究觀察由硫代乙酰胺(TAA)誘導的和膽管結扎術(BDL)后膽汁淤積引起的肝硬化大鼠小腸黏膜形態(tài)結構的改變和內毒素水平的增高來闡明兩者之間的密切相關性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 硫代乙酰胺(TAA)、內毒素鱟試劑盒(廈門市鱟試劑實驗廠有限公司)、光鏡、電鏡、分光光度計。

1.2 肝硬化大鼠模型制作 實驗動物隨機分為3組:正常對照組、模型組每組12只。正常對照組:腹腔內注射注射用水0.5 mL，每周兩次(周一、周四)，共8周;模型組(TAA組):腹腔內注射10%TAA 200 mg/kg(首次劑250 mg/kg)，每周2次(周一、周四)，共8周;模型組(BDL組):自由飲水和飲食1周后，行膽總管結扎術，8周成模;大鼠造模死亡率為52.7%，最后成模共17只，TAA組10只，BDL組7只。

1.3 腸壁組織光鏡觀察 取十二指腸下空腸，生理鹽水沖洗后在50%甲醛液中固定，石蠟包埋，切片后用常規(guī)蘇木精伊紅染色，切片光鏡下觀察。

1.4 腸壁組織電子顯微鏡觀察 取十二指腸下空腸，生理鹽水沖洗后，以2.5%的戊二醛固定，經脫水、包埋，超薄切片后于透射電鏡下觀察小腸黏膜超微結構改變。

1.5 血漿內毒素的檢測 在無菌條件下采取腹主動脈血5 mL，采用顯色基質鱟試劑盒，操作步驟按其說明書進行，結果以Eu/mL表示。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 15.0軟件，數據以均數±標準差表示，兩組計量資料的比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腸黏膜HE染色 光鏡下觀察到正常大鼠腸黏膜組織完整，絨毛整齊，上皮細胞形態(tài)正常，未見黏膜充血水腫和炎性細胞浸潤，肝硬化伴內毒素血癥大鼠腸黏膜絨毛稀疏、萎縮，上皮細胞壞死，黏膜水腫伴有炎性細胞浸潤(見圖1)，并且發(fā)現TAA組大鼠腸黏膜改變較BDL組更嚴重。

圖1 各組大鼠腸黏膜HE染色(100×)A:正常組;B:BDL組;C:TAA組Fig 1 Rat intestinal mucosa(HE 100×)A:control group;B:BDL group;C:TAA group

2.2 小腸黏膜超微結構的改變 正常對照組沒有小腸黏膜超微結構的改變，TAA組和BDL組大鼠小腸黏膜出現超微結構的改變，電鏡下觀察到模型組大鼠小腸壁結構有明顯改變，腸黏膜絨毛破壞、減少、變短、倒伏、缺失，腸黏膜緊密間隙增寬，腸黏膜杯狀細胞分泌減少，腸黏膜上皮細胞內線粒體和內質網腫脹(見圖2～6)。

2.3 血漿內毒素 正常對照組血漿內毒素素水平(0.043+0.011)Eu/mL，TAA 組血漿內毒素水平為(0.667+0.159)Eu/mL，與正常對照組比較，顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義。BDL組血漿內毒素水平為(0.806+0.382)Eu/mL，與 TAA 組比較，顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義。

3 討論

腸黏膜屏障功能指的是腸黏膜本身及黏膜前后因素的總稱，包括機械屏障、生物屏障和免疫屏障等，其主要作用是阻止腸道內有害物質(如腸內的細菌和毒素)進入體循環(huán)［1］。腸黏膜的機械屏障主要由腸上皮細胞及其緊密連接組成，其功能受損可以導致腸壁通透性增加，成為細菌及其產物的細胞旁通路，進入腸系膜淋巴結與門靜脈循環(huán)，從而引起局部和全身的感染［2］。肝硬化機體免疫力下降等情況下，腸道內的致病菌特別是革蘭陰性菌就會大量生長、繁殖并釋放大量的內毒素可直接引起腸黏膜屏障損傷。本研究結果顯示，與正常對照組相比較，藥物性肝硬化和膽汁淤積性引起的肝硬化模型組光鏡下觀察到肝硬化大鼠小腸腸黏膜絨毛稀疏、萎縮，上皮細胞壞死，黏膜水腫伴有炎性細胞浸潤，并且膽汁淤積性肝硬化病變程度較重，可能與膽汁酸分泌減少、膽鹽的缺乏等有關;電鏡下觀察到模型組大鼠小腸壁結構有明顯改變，腸黏膜絨毛破壞、減少、變短、倒伏、缺失，腸黏膜緊密間隙增寬，腸黏膜杯狀細胞分泌減少，腸黏膜上皮細胞內線粒體和內質網腫脹。模型組血漿內毒素水平明顯升高，并且BDL組內毒素水平高于TAA組，推測可能內毒素參與了機體自身免疫反應的發(fā)生，全身免疫系統(tǒng)被激活，導致機體免疫紊亂。Parks等［3］學者也觀察到在膽管結扎肝硬化大鼠模型小腸黏膜形態(tài)受損，引起內毒素水平升高和腸道細菌移位。

這些現象提示，肝硬化時腸黏膜結構形態(tài)發(fā)生改變，腸黏膜屏障受損，腸壁的通透性增加，內毒素由腸道吸收增多。進入血循環(huán)中的內毒素直接損傷腸黏膜上皮細胞、線粒體和內質網，并引起腸微血管收縮，使腸黏膜血流量減少，腸組織缺血、缺氧，長期缺血缺氧，又加劇內毒素的吸收，形成惡性循環(huán)，同時，肝硬化時，Kupffer細胞功能、代謝嚴重受損對內毒素的清除能力下降故進入肝臟的內毒素不能被及時清除［4］，也可引起腸源性內毒素血癥。Such等［5］學者通過光鏡觀察到十二指腸絨毛的高度和寬度之比發(fā)生很大的變化。電鏡下觀察到肝硬化患者十二指腸黏膜的超微結構發(fā)生改變，細胞間隙增寬;提出肝硬化時發(fā)生感染是由于細菌通過腸黏膜屏障從腸道官腔移位到腸系膜淋巴結引起的，腸黏膜形態(tài)改變有利于細菌移位。細菌過度生長、細菌移位是肝硬化發(fā)生自發(fā)性腹膜炎的主要原因之一。我國學者任衛(wèi)英等［6］認為小腸細菌過度生長、腸道細菌移位等同樣也是肝硬化患者易發(fā)生內毒素血癥時不可忽視的因素，可能與正常小腸壁結構的改變有一定的關系。同樣，Chiva等［7］學者通過實驗觀察到有細菌移位的肝硬化大鼠回腸和盲腸黏膜的氧化損傷嚴重，提出腸道黏膜屏障的完整性在肝硬化細菌移位的發(fā)病機制中可能起著重要的作用。肝硬化大鼠門脈高壓時腸道屏障完整性受損產生的自由基代謝物參與了肝硬化大鼠的細菌移位。Bauer等［8］學者也觀察到肝硬化患者存在小腸細菌過度生長，其與內毒素密切相關，細菌數量可能是內毒素水平的決定因素，而不是菌群種類組成。也有學者［9］報道肝硬化大鼠腸道菌群失調能夠引起細菌移位和肝臟功能的改變，實驗發(fā)現肝硬化大鼠腸道桿菌水平高于正常對照組，給予雙歧桿菌和腸球菌治療后，腸道桿菌水平和內毒素水平都有所降低。Lata等［10］學者也報道微生態(tài)制劑可以改善肝硬化患者的腸道菌群和肝功能Child-Pugh評分，降低內毒素水平。這些研究理論對臨床上防治肝硬化的內源性感染和腸源性內毒素血癥有一定的價值。

內源性感染是肝硬化常見的并發(fā)癥之一，腸道是內源性感染的主要來源，其中最為常見的是自發(fā)性腹膜炎和腸源性內毒素血癥。肝硬化引起的腸源性內毒素血癥對肝臟的損害，除內毒素本身的直接作用外，主要與內毒素激活巨噬細胞，使其產生與釋放細胞因子有關，如腫瘤壞死因子 α、白介素(IL-1、IL-6、IL-8)，血小板活化因子、白三烯、氧自由基、內皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)等共同參與對肝組織的損傷，已有學者［11］正在臨床研究證實，膽管結扎后所致的肝硬化大鼠存在內毒素血癥，同時腫瘤壞死因子水平顯著增高。

另外，肝硬化時，內毒素容易進入體循環(huán)的原因還有很多，如肝臟解毒能力下降、門體分流以及機體免疫功能受損等，同樣，內毒素進入人體后使機體免疫力下降［12］。

內毒素血癥、腸黏膜屏障衰竭在晚期肝硬化患者中大量存在，阻止其惡性循環(huán)的發(fā)生是治療肝硬化患者的關鍵之一，是預防肝功能衰竭的重要環(huán)節(jié)。加強和深入對肝硬化患者腸黏膜屏障損傷的研究對防治腸源性內毒素血癥具有重要意義。有報道［13］:西沙比利通過促進小腸蠕動和改善腸道滲透率可能有助于防止腸道細菌移位和內毒素血癥。因此，通過調節(jié)腸道菌群、增加腸道動力、營養(yǎng)支持等方面來防治肝硬化內毒素血癥的發(fā)生。

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