劉 艷 ，金延安 ，劉俐敏

(1.湖北科技學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100;2.武漢科技大學(xué)病理學(xué)教研室)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在癌癥病死率中排列第二位［1］，而血管生成在腫瘤細胞的生長及擴散中起核心作用，是胃癌的主要轉(zhuǎn)移途徑。血紅素氧合酶(heine oxygenase，HO)-1 是一種可誘導(dǎo)型酶蛋白，是機體最重要的內(nèi)源性防御體系之一，目前研究發(fā)現(xiàn)在人體多種腫瘤組織中均可檢測到HO-1 高表達［2］，但其與血管重構(gòu)及臨床病理關(guān)系鮮見報道。本實驗研究胃癌組織中MVD 和HO-1 的表達與血管生成及侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標本及來源

選擇2000～2005年咸寧市中心醫(yī)院病理科胃癌活檢和手術(shù)切除標本61例，其中男36例，女25例，年齡32～76歲，平均(58.3±6.7)歲。根據(jù)2002年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)胃癌TNM分期法，本組病例Ⅰ期9例，Ⅱ期11例，Ⅲ期14例，Ⅳ期27例。取距離癌組織＞5cm 的正常組織28例作為正常對照組。所有患者術(shù)前均未進行放化療。標本均經(jīng)10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋。

1.2 組織芯片制作

選擇所需病例存檔蠟塊，由病理學(xué)專家根據(jù)蘇木素-伊紅染色法(HE)切片進行形態(tài)學(xué)觀察，確定具有代表性的病變部位并標記，用組織芯片制作儀在受體蠟塊上打孔(直徑1.5 mm)，然后在供體蠟塊上打孔采集組織芯(直徑1.5 mm)，推入空白陣列模塊中。如此反復(fù)將所有組織芯整齊有序地安插在空白蠟塊中，制成組織芯片蠟塊。將制成的組織芯片蠟塊置于模具中，60℃烤箱放置1 h，使蠟塊重新融為一體。將組織芯片蠟塊靜置自然冷卻。將制好的組織芯片蠟塊在輪轉(zhuǎn)式切片機上做4μm 連續(xù)切片，敷貼于1%多聚賴氨酸處理的載玻片上。

1.3 免疫組化

采用UltraSensitive SP 二步免疫組織化學(xué)法檢測。UltraSensitive SP 免疫組織化學(xué)試劑盒、CD34 鼠抗人單克隆抗體(1∶100 稀釋)和HO-1 即用型鼠抗人單克隆抗體(1∶100 稀釋)均為福州邁新公司產(chǎn)品。按試劑盒說明書方法操作。

1.4 結(jié)果判定

①HO-1 染色判斷標準［2］:HO-1 陽性染色顆粒主要位于細胞漿內(nèi)，其陽性表達的細胞呈棕褐色。低倍鏡下隨機選取10個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，取其平均值，結(jié)果以陽性細胞所占百分比表示。用醫(yī)學(xué)病理圖像分析系統(tǒng)對圖象進行采集和分析，灰度值數(shù)值越小，表明陽性表達越多;②腫瘤組織微血管密度(MVD)計數(shù)方法:用CD34 單克隆抗體進行免疫組化染色，標記腫瘤微血管，采用Weidner 法［3］進行計數(shù)，先用低倍鏡掃視整個切片，尋找MVD 密度最高的區(qū)域，然后在高倍視野下分別計數(shù)腫物中心及腫物邊緣的微血管數(shù)，共計數(shù)5個視野，取平均值來作為該例的MVD。

1.5 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 11.0 軟件，依據(jù)資料類型的不同分別采用χ2檢驗、成組設(shè)計的t 檢驗;相關(guān)性采用等級相關(guān)分析;P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MVD、HO-1 在胃癌組織和正常胃組織中的表達

HO-1 陽性染色顆粒主要位于細胞漿內(nèi)，癌細胞中呈強陽性表達，表達率為71.4%，在正常胃組織僅有個別細胞呈陽性染色，表達率為11.0%，兩者比較有統(tǒng)計學(xué)意義;MVD 在正常胃組織中表達平均值為(43.6±11.2)個/視野，胃癌組織中表達平均值為(62.1±13.1)個/視野，兩者比較也有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

圖1 HO-1 基因免疫組化SP×400

圖2 CD34 免疫組化SP×400

表1 HO-1、MLD 在胃癌及正常胃組織中的表達

表2 MLD 和HO-1 表達與胃癌臨床病理因素之間的關(guān)系

2.2 MVD、HO-1 的表達與臨床病理關(guān)系

胃癌組織中HO-1 陽性表達與患者性別、年齡的相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);而與TNM分期、分化程度、腫瘤浸潤深度的相關(guān)性均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，MVD 值在Ⅲ～Ⅳ期胃癌組顯著高于Ⅰ～Ⅱ期胃癌組(P＜0.01)，在侵及肌層組中的MLD 顯著高于侵及黏膜層組(P＜0.01):與患者性別、年齡的相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

2.3 MVD、HO-1 表達的相關(guān)分析

經(jīng)Spearman 相關(guān)分析，25例HO-1 高表達者MVD 平均值為(62.1±13.1)個/視野，36例HO-1高表達者MVD 平均值為(43.6±11.2)個/視野，兩者在胃癌中表達呈顯著正相關(guān)(r=0.4022，P＜0.05)。

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個高度復(fù)雜及多步驟的過程，是患者死亡的主要原因，而血管生成在腫瘤細胞的生長及擴散中起核心作用。血管重構(gòu)是血管對各種刺激的復(fù)雜動態(tài)反應(yīng)過程，涉及刺激信號的感受、傳導(dǎo)以及細胞因子的合成、釋放等諸多環(huán)節(jié)。HO-1 通過影響各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡、減輕炎性反應(yīng)、抑制炎性因子的表達等多種細胞分子機制發(fā)揮抗血管重構(gòu)作用［4］。本研究中發(fā)現(xiàn)HO-1 癌細胞中呈強陽性表達，表達率為71.4%，在正常胃組織僅有個別細胞呈陽性染色，與Sasaki T［5］報道一致。有報道在肝癌旁組織也可檢測到HO-1 高表達，人胰腺癌周圍炎性細胞也呈陽性表達［6］，這些現(xiàn)象提示HO-1 表達可能與癌組織周圍炎性反應(yīng)有關(guān)，是因為癌旁組織產(chǎn)生的炎性細胞因子，以及腫瘤病灶周圍積聚的游離鐵離子等刺激HO-1 表達，HO-1 在新生血管生成中起刺激作用，說明HO-1 與腫瘤血管生成密切相關(guān)，可能利于胃癌浸潤。因此探討HO-1 在胃癌組織中的表達水平與臨床病理特征的相互關(guān)系對研究腫瘤生物學(xué)行為極具價值。

HO-1 對血管發(fā)生的作用最先是在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤、人黑素瘤中通過腫瘤巨噬細胞浸潤伴MVD增加這一現(xiàn)象而被認識的［6］，因此MVD 亦能反映HO-1 在血管發(fā)生中的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)HO-1對腫瘤新生血管的影響與巨噬細胞在腫瘤中滲透及血管密度增加有顯著關(guān)系［7］，HO-1 通過提高大鼠腫瘤新生血管的生長加速了癌的生長，HO-1抑制劑削弱了裸鼠胃癌的致癌活性［8］。本研究中發(fā)現(xiàn)胃癌組織中MVD 、HO-1 陽性表達與患者性別、年齡的相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);而與TNM分期、分化程度、腫瘤浸潤深度的相關(guān)性均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。通過以上研究說明HO-1 在新生血管生成中起刺激作用，它對腫瘤組織有保護作用，也可能利于胃癌浸潤轉(zhuǎn)移，如果抑制HO-1 活性，可能對腫瘤的治療有利。

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