西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院（西安710004）

張 潔 李雅莉 楊 俠 張進召 張秋紅 明宗娟 張永紅 周淑茹

RECK是一種新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制相關(guān)基因，廣泛表達于人體的多個組織中，在腫瘤組織中幾乎不表達或微量表達，在癌旁正常組織中表達是正常的［1］。國內(nèi)外研究報道RECK基因有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）降解ECM的作用，從而抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移并改善預(yù)后。本研究采用免疫組化法在蛋白水平檢測RECK及基質(zhì)金屬蛋白酶－9（MMP－9）在非小細胞肺癌（NSCLC）癌組織及非癌組織中的表達及其相互關(guān)系，為RECK在NSCLC的基因治療提供理論依據(jù)。

資料與方法

1 一般資料 NSCLC（鱗癌和腺癌）病例50例，術(shù)前均未接受放、化療及免疫治療。其中男34例，女16例；年齡34～76歲，中位年齡61歲；肺鱗癌27例，肺腺癌23例；高分化6例，中等分化24例，低分化20例；TNM分期：I期9例，II期16例，III期15例，IV期10例；肺門和（或）縱隔淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移（簡稱轉(zhuǎn)移）：有轉(zhuǎn)移31例，無轉(zhuǎn)移19例。另選取20例非癌組織，其中男14例，女6例，年齡42～69歲，中位年齡63．5歲；11例為癌旁正常肺組織，6例為慢性炎癥，3例為正常肺組織。

2 方 法 采用免疫組化SP法。鼠抗人RECK mAb多克隆抗體（第一抗體）和兔抗人MMP－9 mAb多克隆抗體（第一抗體）購自美國Santa Cr uz公司；UltraSensitive T MS－P超敏試劑盒，購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。全部標本經(jīng)甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚4μm，然后進行免疫組化染色，免疫組化染色過程嚴格按照說明書進行。兩種一抗實際工作濃度1∶100，使用PBS緩沖液（0．01 mol/L，p H＝7．4）代替RECK抗體及 MMP－9抗體作陰性對照，使用已知陽性的食管癌切片做陽性對照。

3 結(jié)果判定 根據(jù)視野中陽性細胞所占比例作為該切片陽性細胞的百分率進行評分：＜30%為1分，30%～70%為2分，＞70%為3分。以多數(shù)呈現(xiàn)的染色特征為計分標準對染色強度進行打分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。最后以陽性細胞百分率計分和染色強度計分相加所得的總分進行結(jié)果判定：0～1分為陰性（－），2～3分為弱陽性（＋），≥4分為強陽性（），弱陽性和強陽性統(tǒng)計為陽性。

4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13．0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理。用χ2檢驗、Fisher確切概率法及分類變量的關(guān)聯(lián)性分析（r）等方法，分析免疫組化結(jié)果與患者臨床特征、病理類型等的關(guān)系，α取0．05。

結(jié) 果

1 RECK和MMP－9在肺癌組織和非癌組織中的表達 見表1。RECK蛋白陽性表達主要在細胞漿，陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒呈均勻分布。RECK蛋白在癌組織中的陽性表達率為20．0%（10/50），而在非癌組織中的陽性表達率為90．0%（18/20），兩者有顯著性差異（P＜0．001）。MMP－9蛋白陽性表達主要位于細胞漿，陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒呈均勻分布。MMP－9蛋白在癌組織中的陽性表達率為88．1%（44/50），而在非癌組織中的陽性表達率為15．0%（3/20），兩者有顯著性差異（P＜0．001）。提示RECK蛋白在癌組織中呈低表達，在非癌組織中呈高表達；而MMP－9蛋白在癌組織中呈高表達，在非癌組織中呈低表達。

表1 RECK和MMP－9蛋白在NSCLC癌組織和非癌組織中的表達

2 RECK和 MMP－9的表達及其NSCLC臨床特征的關(guān)系 見表2。在肺癌組織中，RECK及MMP－9的表達水平與患者的年齡、性別、是否吸煙及吸煙量、病理類型、分化程度無明顯關(guān)系（P 均＞0．05），與患者是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)（P均＜0．05）。與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且TNM分期早期的患者相比，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和（或）TNM 晚期患者的RECK蛋白表達水平升高，而MMP－9則降低，兩者之間有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．001）。

表2 RECK和MMP－9與肺癌臨床特征之間的關(guān)系

3 RECK和MMP－9蛋白表達在非小細胞肺癌中的關(guān)系 在50例標本中，有40例NSCLC患者癌組織RECK蛋白表達陰性而MMP－9蛋白表達陽性；有6例NSCLC患者癌組織RECK蛋白表達陽性而MMP－9蛋白表達陰性。兩者經(jīng)χ2檢驗及相關(guān)性分析，有負相關(guān)關(guān)系（χ2＝27．273，r＝－0．739，P＜0．001）。

討 論

RECK基因廣泛表達于人體的多個組織中，但在腫瘤組織中幾乎是不表達或微量表達的。RECK的mRNA能在非轉(zhuǎn)染的NI H/3 T3細胞中表達，但是在ras轉(zhuǎn)染的NI H3T3細胞中卻不表達或表達下降，原癌基因如ras、myc、mos、src等可下調(diào)RECK基因的表達［1］，通過抑制RECK基因來實現(xiàn)腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。MMPs可釋放抑制細胞凋亡的生物活性分子，并通過分解ECM（細胞外基質(zhì)）來刺激腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移［2］。MMPs還可通過促進血管生成，封閉免疫監(jiān)視，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答來促進腫瘤生長［3］。MMPs在人體正常組織中的表達和活性是非常低的，并且是被精細調(diào)節(jié)的［4］。但當機體處于組織重塑時期或是在病理情況下如癌癥時，可迅速誘導(dǎo)MMPs的表達和活性［5］。

RECK基因?qū)MPs的抑制是一個復(fù)雜的多階段的過程，包括轉(zhuǎn)錄水平的抑制，mRNA水平的抑制，蛋白酶的分泌和蛋白酶活性的抑制過程，通過這些復(fù)雜的過程，抑制ECM的降解和腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。Taku等［6］發(fā)現(xiàn)在RECK基因敲除的小鼠胚胎期，雖然有新生血管形成，但血管的成熟受到明顯抑制，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)這些變異的胚胎體積小，間充質(zhì)混亂，缺乏膠原纖維，有異常的組織發(fā)生；而恢復(fù)RECK基因的表達可抑制腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管發(fā)生。RECK可抑制MMPs，從而抑制腫瘤的進展，并且是一個獨立的顯著的預(yù)后因素，RECK基因表達水平高的患者預(yù)后明顯好于表達水平低的患者。

本實驗結(jié)果顯示RECK和MMP－9在非癌組織和癌組織中均有表達，RECK在癌組織中的表達水平較非癌組織顯著降低，而MMP－9的表達情況則反，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．001），可推測肺癌組織中RECK基因被抑制，而MMP－9基因被誘導(dǎo)表達增加。RECK及MMP－9蛋白表達和NSCLC患者的性別、年齡及吸煙指數(shù)無關(guān)，這與Norihiro等［7］及Kazu masa等［8］研究結(jié)果相符。這說明雖然肺癌的發(fā)生及病理組織類型有性別、年齡的差異，但它們與肺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移沒有直接的關(guān)系；煙草雖然是肺癌最重要的危險因素，但它與RECK和MMP－9蛋白表達水平及調(diào)節(jié)機制關(guān)系甚微。RECK蛋白與 MMP－9蛋白表達與NSCLC的病理類型、分化程度無關(guān)，而與TNM分期有密切關(guān)系，TNM分期越晚，RECK蛋白表達越低，MMP－9蛋白表達越高，提示 MMP－9可促進NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移，而RECK基因可抑制NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移。故MMP－9可作為判斷肺癌早期轉(zhuǎn)移的一個指標，而RECK基因可作為判斷肺癌預(yù)后的一個指標。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中，RECK蛋白表達陽性率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；而 MMP－9蛋白表達陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。提示淋巴結(jié)作為局部免疫器官，在NSCLC的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。

RECK基因與MMP－9之間存在著顯著的負相關(guān)關(guān)系的結(jié)果提示，RECK基因可能是 MMP－9的負調(diào)節(jié)因子，RECK基因通過抑制MMP－9發(fā)揮抑癌作用。當NSCLC患者癌組織中的RECK基因被致癌信號下調(diào)之后，解除了對MMP－9分泌和活性的抑制，促進了NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移?；赗ECK基因與MMP－9之間的這種負相關(guān)關(guān)系，可以作為肺癌RECK基因治療的理論基礎(chǔ)，通過上調(diào)RECK基因，抑制MMP－9基因的表達，從而達到抑制肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

［1］Takahashi C，Sheng Z，Horan TP，et al．Regulation of matrix metalloproteinase 9 and inhibition t u mor invasion by the me mbrane－anehored glycoprotein RECK［J］．Proc Natl Acad Sci，1998，95（11）：13221－13226．

［2］Sternlicht MD，Werb Z．How matrix metalloproteinases regulate cell behavior［J］．Annu Rev Cell Dev Biol，2001，17：463－516．

［3］Overall CM，Lopez－Otin C．Strategies for MMP inhibition in cancer：innovations for the post－trial era［J］．Nat Rev Cancer，2002，2（9）：657－672．

［4］Matrisian L M．Matrix metallopr oteinase gene expression［J］．Ann NY Acad Sci，1994，732：42－50．

［5］Wester marck J，Kahari V M．Regulation of matrix metallo－proteinase expression in tu mor invasion［J］．Faseb J，1999，13（8）：781－792．

［6］Taku T，Miehiyoshi H，Mitsuo N，et al．The membraneanchored matrix metalloproteinase （MMP）regulator RECK in co mbination with MMP－9 serves as an infor mative pr ognostic indicator for colorectal cancer［J］．Clin Cancer Res，2004，10（8）：5572－5579．

［7］Norihiro T，Mitsuhiro T，Yasuhiro H，et al．Low expression of reversion－inducing cysteine－rich protein with Kazal motifs（RECK）indicates a shorte survival after resection in patients with adenocarcino ma of the lung［J］．Lung Cancer，2007，58：376－383．

［8］Kazu masa T，Shinya I，Yozo K，et al．Expression of a novel matrix metalloproteinase regulator，RECK，and its clinical signifi cance in resected non－s mall cell lung cancer［J］．Eur opean Jour nal of Cancer，2004，40：1617－1623．