李欣曹宏樊洪

骨缺損的修復(fù)一直是困擾臨床的難題，傳統(tǒng)的修復(fù)方法有自體骨移植、異體骨移植和人工植骨材料，但是各種骨移植術(shù)都有其局限性。骨組織工程學(xué)的出現(xiàn)及發(fā)展為解決骨缺損提供了新思路。骨組織工程支架材料是骨組織工程修復(fù)骨缺損的載體材料，理想的支架材料必須具備良好的生物相容性和可降解性，一定的機(jī)械強(qiáng)度、三維多孔結(jié)構(gòu)和骨傳導(dǎo)性[1]。聚羥基乙酸（PGA）是由美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證并批準(zhǔn)可應(yīng)用于組織工程研究的生物材料之一,目前已廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。β-TCP有良好的骨傳導(dǎo)性及生物降解性，常作為復(fù)合人工骨的基料[2]。本研究以PGA和β-TCP為復(fù)合支架的基料，制備不同質(zhì)量比例下所得復(fù)合支架，并觀察復(fù)合支架微觀結(jié)構(gòu)，測(cè)試其孔隙率及抗壓強(qiáng)度。

1 材料與方法

1.1 材料 P GA顆粒（Polyglycolide，Sigma-Aldrich），化學(xué)式C2H4O3，相對(duì)分子質(zhì)量10 231，熔點(diǎn)為225℃~230℃；β-TCP粉末（Sigma-Aldrich），純度大于98%，化學(xué)式Ca3O8P2，相對(duì)分子質(zhì)量310.18。

1.2 主要試劑與儀器 六 氟異丙醇(HFIP，F(xiàn)luka)溶液，純度大于99%，化學(xué)式C3H2F6O，熔點(diǎn)為59℃；NaCl顆粒（AR，天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心）；XL-30環(huán)境掃描電子顯微鏡（荷蘭Phlilps）；M350-20KNCX萬能材料試驗(yàn)機(jī)（Testometric公司，英國(guó)）；MTFY通風(fēng)櫥（天津市拉貝爾實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）；H-SWX-42085電熱恒溫水溫箱（上海新苗醫(yī)療機(jī)械制造有限公司）；QL-861型旋渦混合器（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 PGA的溶解 將 0.13 g PGA分別放入盛有1 mL HFIP的玻璃樣品瓶中。密封完好后放入50℃恒溫水浴箱6~8 h。1.3.2 PGA/β-TCP支架的制備 稱 取0.13 g、0.39 g β-TCP粉末，分別放入已溶解的PGA溶液中，混合器混合15~30 min。將所得懸浮液滴入3 mm×2 mm的玻璃模具內(nèi)1 mm，迅速加入0.02 g NaCl粒子，振動(dòng)模具直到懸浮液凝固。室溫下將模具放入通風(fēng)櫥內(nèi)2 d后脫模，干燥去除殘留溶劑。將試樣放入盛有蒸餾水的燒杯內(nèi)去除NaCl顆粒，每隔12 h更換蒸餾水持續(xù)3 d，真空干燥后放入樣品瓶?jī)?nèi)密封保存[3]。

1.3.3 支架材料抗壓強(qiáng)度測(cè)試 用 萬能材料試驗(yàn)機(jī)分別對(duì)0.13 g PGA/0.13 g β-TCP（A 組 ）、0.13 g PGA/0.39 g β-TCP（B組）試樣進(jìn)行抗壓縮強(qiáng)度的測(cè)試。測(cè)試時(shí)每組測(cè)試6個(gè)試樣，加載速率為1.0 mm/min[4]。

1.3.4 支架材料的孔隙率 用 液體置換法測(cè)試支架材料的孔隙率[5]。實(shí)驗(yàn)選擇無水乙醇作為置換液體，將試樣放入盛有一定容積（V1）無水乙醇的量筒中，密封量筒。靜置10 min，在試樣被無水乙醇完全浸透且試樣表面無氣泡時(shí)，此時(shí)無水乙醇和充滿無水乙醇的支架材料的總體積記為V2，然后將充滿無水乙醇的支架材料試樣從量筒中取出,剩余的無水乙醇體積記為V3，體積差V1-V3代表的是浸入支架材料的無水乙醇的體積,即支架孔隙體積。支架材料的總體積為V2-V3?？紫堵实挠?jì)算公式為：孔隙率ε=（V1-V3）（/V2-V3）×100%。

1.3.5 支架材料的細(xì)微結(jié)構(gòu) 將 支架材料表面進(jìn)行噴金，用電子顯微鏡（SEM）對(duì)其表面進(jìn)行觀察，了解支架材料的孔徑、孔之間的貫通性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采 用SPSS 16.0軟件處理，正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組獨(dú)立樣本資料行t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 抗壓強(qiáng)度和孔隙率測(cè)試 A組抗壓縮強(qiáng)度值明顯低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。2組支架材料孔隙率均大于85%。A組孔隙率明顯高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1。

Table 1 Results of compressive strength test in two groups表1 2組支架抗壓縮測(cè)試結(jié)果 （±s）

Table 1 Results of compressive strength test in two groups表1 2組支架抗壓縮測(cè)試結(jié)果 （±s）

**P＜0.01

組別A組B組t n66抗壓強(qiáng)度（kPa）173.833±36.140 731.283±55.214 20.692**孔隙率（%）93.1±0.7 89.3±0.6 9.927**

2.2 SEM形貌分析 2組材料內(nèi)部孔隙相互連通，為三維連通、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其平均孔徑約為200~300 μm，見圖1。支架孔壁中存在大量微孔，形成蜂窩狀結(jié)構(gòu)，β-TCP均勻地分散于聚合物中，A組支架材料中β-TCP顆粒明顯少于B組。支架材料微孔表面粗糙，且隨著β-TCP比重的提高，PGA/β-TCP支架材料的表面粗糙度增加，見圖2。

Figure 1 SEM images of scaffolds in A and B groups(×72)圖1 A、B組支架材料SEM照片（×72）

Figure 2 SEM images of scaffolds in A and B groups(×300)圖2 A、B組支架材料SEM照片（×300）

3 討論

骨組織工程支架材料的發(fā)展直接取決于材料技術(shù)的變化，特別是可用于重建大型骨科缺陷和有良好機(jī)械性能的可降解生物材料。

支架材料的孔隙結(jié)構(gòu)是評(píng)價(jià)支架材料一個(gè)重要的參數(shù)。研究表明充足的血液供應(yīng)是形成良好骨組織的基礎(chǔ)，孔隙率與孔徑大小對(duì)其有決定性的影響[6]?？紫堵屎涂讖街g貫通性對(duì)養(yǎng)分和氣體的傳輸、細(xì)胞生長(zhǎng)過程中新陳代謝產(chǎn)物的排出都有十分重要的作用?？讖酱笮⊥瑯邮墙M織工程支架的重要指標(biāo)。如果孔徑太小，支架的孔隙會(huì)被細(xì)胞堵住，這就不利于細(xì)胞長(zhǎng)入支架內(nèi)部，而細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的養(yǎng)分及代謝產(chǎn)物不能及時(shí)輸入和輸出，并最終影響組織的重建。組織工程支架的孔徑尺寸應(yīng)在200~400 μm范圍內(nèi)有利于新生骨組織在孔隙內(nèi)部礦化沉積[7]。表面形貌可影響材料的骨傳導(dǎo)特性，粗糙的材料表面比光滑表面更有利于蛋白的吸附和骨細(xì)胞的黏附、遷移及增殖等。力學(xué)性能是組織工程支架材料另一個(gè)重要性能指標(biāo)。骨組織工程支架材料的力學(xué)性能要滿足臨床操作的要求，并能夠?yàn)樾迯?fù)部位的組織再生提供一定的力學(xué)支撐。成品塊狀的β-TCP支架材料有較好的機(jī)械強(qiáng)度，但孔隙率較低，PGA支架孔隙率高但多為膜狀或纖維狀，無法滿足骨缺損修復(fù)的要求。傳統(tǒng)的溶劑澆鑄-粒子瀝濾法制備的支架有厚度限制，致孔劑粒子在黏度較大的混合溶液中很難分散均勻，且支架材料表面易形成致密皮層，影響了支架材料的貫通性[8]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)制備了PGA/β-TCP復(fù)合材料，利用改良溶劑澆鑄/粒子瀝濾技術(shù)，將PGA溶液、β-TCP制成均勻的混合物，在超聲振動(dòng)下將混合物倒入模具，加入定量致孔劑鹽粒子,使鹽粒子略高出混合物液面至大部分溶劑揮發(fā)。這就使致孔劑粒子可均勻分布在混合溶液中，而且避免了材料表面形成致密表層，改善了支架材料的貫通性。本研究結(jié)果顯示，PGA為基體構(gòu)成支架材料的主體，β-TCP顆粒作為充填相均勻地鑲嵌在PGA有機(jī)相網(wǎng)狀孔隙表面，使支架材料表面粗糙，為成骨細(xì)胞提供附著點(diǎn)和有利于成骨細(xì)胞附著的表面。本研究測(cè)得A組抗壓縮強(qiáng)度值明顯小于B組，孔隙率大于B組，這是因?yàn)棣?TCP顆粒在支架材料中起到增強(qiáng)填充的作用，隨著β-TCP顆粒含量的增加，支架材料的致密程度增加,抗壓強(qiáng)度也隨之增加。β-TCP的增加同時(shí)會(huì)降低支架材料的孔隙率，這可能是由于β-TCP沉淀堵塞了致孔劑形成的孔隙。賈舜宸等[9]研究原位共聚法制備PDLLA/β-TCP復(fù)合支架時(shí)發(fā)現(xiàn)β-TCP的增加對(duì)材料抗壓強(qiáng)度的增強(qiáng)作用不明顯，這是因?yàn)棣?TCP雖作為增強(qiáng)填料但具有親水性，其加入不利于丙交酯的開環(huán)聚合過程，導(dǎo)致基體分子質(zhì)量降低使材料強(qiáng)度降低。本實(shí)驗(yàn)中PGA溶液與β-TCP顆粒只是機(jī)械混合，兩者并沒有發(fā)生化學(xué)作用，PGA的分子質(zhì)量沒有改變。Hao等[10]研究發(fā)現(xiàn)CS/β-TCP復(fù)合支架材料，當(dāng)β-TCP質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0~70%范圍時(shí)，支架材料孔隙率隨β-TCP的增加而降低。原因可能是β-TCP的增加，CS/β-TCP的固/液比增加，液體所占的空間比例變小，濾除溶劑后支架孔隙率降低。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)制備的質(zhì)量比例為1∶1與1∶3的PGA/β-TCP復(fù)合支架材料孔隙率均在85%以上，1∶3質(zhì)量比的PGA/β-TCP復(fù)合支架抗壓縮強(qiáng)度顯著高于1∶1質(zhì)量比復(fù)合支架。1∶3質(zhì)量比的PGA/β-TCP復(fù)合支架更能適應(yīng)臨床對(duì)支架材料的要求。

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