李欣曹宏樊洪
骨缺損的修復(fù)一直是困擾臨床的難題,傳統(tǒng)的修復(fù)方法有自體骨移植、異體骨移植和人工植骨材料,但是各種骨移植術(shù)都有其局限性。骨組織工程學(xué)的出現(xiàn)及發(fā)展為解決骨缺損提供了新思路。骨組織工程支架材料是骨組織工程修復(fù)骨缺損的載體材料,理想的支架材料必須具備良好的生物相容性和可降解性,一定的機(jī)械強(qiáng)度、三維多孔結(jié)構(gòu)和骨傳導(dǎo)性[1]。聚羥基乙酸(PGA)是由美國食品和藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證并批準(zhǔn)可應(yīng)用于組織工程研究的生物材料之一,目前已廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。β-TCP有良好的骨傳導(dǎo)性及生物降解性,常作為復(fù)合人工骨的基料[2]。本研究以PGA和β-TCP為復(fù)合支架的基料,制備不同質(zhì)量比例下所得復(fù)合支架,并觀察復(fù)合支架微觀結(jié)構(gòu),測試其孔隙率及抗壓強(qiáng)度。
1.1 材料 P GA顆粒(Polyglycolide,Sigma-Aldrich),化學(xué)式C2H4O3,相對分子質(zhì)量10 231,熔點為225℃~230℃;β-TCP粉末(Sigma-Aldrich),純度大于98%,化學(xué)式Ca3O8P2,相對分子質(zhì)量310.18。
1.2 主要試劑與儀器 六 氟異丙醇(HFIP,F(xiàn)luka)溶液,純度大于99%,化學(xué)式C3H2F6O,熔點為59℃;NaCl顆粒(AR,天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心);XL-30環(huán)境掃描電子顯微鏡(荷蘭Phlilps);M350-20KNCX萬能材料試驗機(jī)(Testometric公司,英國);MTFY通風(fēng)櫥(天津市拉貝爾實驗室設(shè)備有限公司);H-SWX-42085電熱恒溫水溫箱(上海新苗醫(yī)療機(jī)械制造有限公司);QL-861型旋渦混合器(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。
1.3 方法
1.3.1 PGA的溶解 將 0.13 g PGA分別放入盛有1 mL HFIP的玻璃樣品瓶中。密封完好后放入50℃恒溫水浴箱6~8 h。1.3.2 PGA/β-TCP支架的制備 稱 取0.13 g、0.39 g β-TCP粉末,分別放入已溶解的PGA溶液中,混合器混合15~30 min。將所得懸浮液滴入3 mm×2 mm的玻璃模具內(nèi)1 mm,迅速加入0.02 g NaCl粒子,振動模具直到懸浮液凝固。室溫下將模具放入通風(fēng)櫥內(nèi)2 d后脫模,干燥去除殘留溶劑。將試樣放入盛有蒸餾水的燒杯內(nèi)去除NaCl顆粒,每隔12 h更換蒸餾水持續(xù)3 d,真空干燥后放入樣品瓶內(nèi)密封保存[3]。
1.3.3 支架材料抗壓強(qiáng)度測試 用 萬能材料試驗機(jī)分別對0.13 g PGA/0.13 g β-TCP(A 組 )、0.13 g PGA/0.39 g β-TCP(B組)試樣進(jìn)行抗壓縮強(qiáng)度的測試。測試時每組測試6個試樣,加載速率為1.0 mm/min[4]。
1.3.4 支架材料的孔隙率 用 液體置換法測試支架材料的孔隙率[5]。實驗選擇無水乙醇作為置換液體,將試樣放入盛有一定容積(V1)無水乙醇的量筒中,密封量筒。靜置10 min,在試樣被無水乙醇完全浸透且試樣表面無氣泡時,此時無水乙醇和充滿無水乙醇的支架材料的總體積記為V2,然后將充滿無水乙醇的支架材料試樣從量筒中取出,剩余的無水乙醇體積記為V3,體積差V1-V3代表的是浸入支架材料的無水乙醇的體積,即支架孔隙體積。支架材料的總體積為V2-V3??紫堵实挠嬎愎綖椋嚎紫堵师?(V1-V3)(/V2-V3)×100%。
1.3.5 支架材料的細(xì)微結(jié)構(gòu) 將 支架材料表面進(jìn)行噴金,用電子顯微鏡(SEM)對其表面進(jìn)行觀察,了解支架材料的孔徑、孔之間的貫通性。
1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采 用SPSS 16.0軟件處理,正態(tài)分布計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,2組獨立樣本資料行t檢驗,檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。
2.1 抗壓強(qiáng)度和孔隙率測試 A組抗壓縮強(qiáng)度值明顯低于B組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。2組支架材料孔隙率均大于85%。A組孔隙率明顯高于B組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表1。
Table 1 Results of compressive strength test in two groups表1 2組支架抗壓縮測試結(jié)果 (±s)
Table 1 Results of compressive strength test in two groups表1 2組支架抗壓縮測試結(jié)果 (±s)
**P<0.01
組別A組B組t n66抗壓強(qiáng)度(kPa)173.833±36.140 731.283±55.214 20.692**孔隙率(%)93.1±0.7 89.3±0.6 9.927**
2.2 SEM形貌分析 2組材料內(nèi)部孔隙相互連通,為三維連通、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),其平均孔徑約為200~300 μm,見圖1。支架孔壁中存在大量微孔,形成蜂窩狀結(jié)構(gòu),β-TCP均勻地分散于聚合物中,A組支架材料中β-TCP顆粒明顯少于B組。支架材料微孔表面粗糙,且隨著β-TCP比重的提高,PGA/β-TCP支架材料的表面粗糙度增加,見圖2。
Figure 1 SEM images of scaffolds in A and B groups(×72)圖1 A、B組支架材料SEM照片(×72)
Figure 2 SEM images of scaffolds in A and B groups(×300)圖2 A、B組支架材料SEM照片(×300)
骨組織工程支架材料的發(fā)展直接取決于材料技術(shù)的變化,特別是可用于重建大型骨科缺陷和有良好機(jī)械性能的可降解生物材料。
支架材料的孔隙結(jié)構(gòu)是評價支架材料一個重要的參數(shù)。研究表明充足的血液供應(yīng)是形成良好骨組織的基礎(chǔ),孔隙率與孔徑大小對其有決定性的影響[6]??紫堵屎涂讖街g貫通性對養(yǎng)分和氣體的傳輸、細(xì)胞生長過程中新陳代謝產(chǎn)物的排出都有十分重要的作用??讖酱笮⊥瑯邮墙M織工程支架的重要指標(biāo)。如果孔徑太小,支架的孔隙會被細(xì)胞堵住,這就不利于細(xì)胞長入支架內(nèi)部,而細(xì)胞生長所需要的養(yǎng)分及代謝產(chǎn)物不能及時輸入和輸出,并最終影響組織的重建。組織工程支架的孔徑尺寸應(yīng)在200~400 μm范圍內(nèi)有利于新生骨組織在孔隙內(nèi)部礦化沉積[7]。表面形貌可影響材料的骨傳導(dǎo)特性,粗糙的材料表面比光滑表面更有利于蛋白的吸附和骨細(xì)胞的黏附、遷移及增殖等。力學(xué)性能是組織工程支架材料另一個重要性能指標(biāo)。骨組織工程支架材料的力學(xué)性能要滿足臨床操作的要求,并能夠為修復(fù)部位的組織再生提供一定的力學(xué)支撐。成品塊狀的β-TCP支架材料有較好的機(jī)械強(qiáng)度,但孔隙率較低,PGA支架孔隙率高但多為膜狀或纖維狀,無法滿足骨缺損修復(fù)的要求。傳統(tǒng)的溶劑澆鑄-粒子瀝濾法制備的支架有厚度限制,致孔劑粒子在黏度較大的混合溶液中很難分散均勻,且支架材料表面易形成致密皮層,影響了支架材料的貫通性[8]。本實驗設(shè)計制備了PGA/β-TCP復(fù)合材料,利用改良溶劑澆鑄/粒子瀝濾技術(shù),將PGA溶液、β-TCP制成均勻的混合物,在超聲振動下將混合物倒入模具,加入定量致孔劑鹽粒子,使鹽粒子略高出混合物液面至大部分溶劑揮發(fā)。這就使致孔劑粒子可均勻分布在混合溶液中,而且避免了材料表面形成致密表層,改善了支架材料的貫通性。本研究結(jié)果顯示,PGA為基體構(gòu)成支架材料的主體,β-TCP顆粒作為充填相均勻地鑲嵌在PGA有機(jī)相網(wǎng)狀孔隙表面,使支架材料表面粗糙,為成骨細(xì)胞提供附著點和有利于成骨細(xì)胞附著的表面。本研究測得A組抗壓縮強(qiáng)度值明顯小于B組,孔隙率大于B組,這是因為β-TCP顆粒在支架材料中起到增強(qiáng)填充的作用,隨著β-TCP顆粒含量的增加,支架材料的致密程度增加,抗壓強(qiáng)度也隨之增加。β-TCP的增加同時會降低支架材料的孔隙率,這可能是由于β-TCP沉淀堵塞了致孔劑形成的孔隙。賈舜宸等[9]研究原位共聚法制備PDLLA/β-TCP復(fù)合支架時發(fā)現(xiàn)β-TCP的增加對材料抗壓強(qiáng)度的增強(qiáng)作用不明顯,這是因為β-TCP雖作為增強(qiáng)填料但具有親水性,其加入不利于丙交酯的開環(huán)聚合過程,導(dǎo)致基體分子質(zhì)量降低使材料強(qiáng)度降低。本實驗中PGA溶液與β-TCP顆粒只是機(jī)械混合,兩者并沒有發(fā)生化學(xué)作用,PGA的分子質(zhì)量沒有改變。Hao等[10]研究發(fā)現(xiàn)CS/β-TCP復(fù)合支架材料,當(dāng)β-TCP質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0~70%范圍時,支架材料孔隙率隨β-TCP的增加而降低。原因可能是β-TCP的增加,CS/β-TCP的固/液比增加,液體所占的空間比例變小,濾除溶劑后支架孔隙率降低。
綜上所述,本實驗制備的質(zhì)量比例為1∶1與1∶3的PGA/β-TCP復(fù)合支架材料孔隙率均在85%以上,1∶3質(zhì)量比的PGA/β-TCP復(fù)合支架抗壓縮強(qiáng)度顯著高于1∶1質(zhì)量比復(fù)合支架。1∶3質(zhì)量比的PGA/β-TCP復(fù)合支架更能適應(yīng)臨床對支架材料的要求。
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