趙 彬 劉 斌 張玉芹

腦出血后通常存在細胞凋亡[1]。依達拉奉（Eda?ravone）是一種新型自由基清除劑，具有抗細胞凋亡和神經(jīng)保護的作用[2]。臨床研究表明，依達拉奉對治療腦出血有確切療效[3]。本研究旨在觀察依達拉奉對大鼠腦出血血腫周圍組織胱冬酶-3（Caspase-3）和程序性細胞死亡分子-5（programmed cell death-5，Pdcd-5）蛋白表達的影響及其作用機制，為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物：普通級雄性Wistar大鼠102只，體質(zhì)量250~300 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號：Scxk（京）-2010-0001。隨機分為假手術(shù)組6只、腦出血組48只和依達拉奉治療組48只。后2組根據(jù)動物術(shù)后處死時間的不同又分為3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d及7 d共8個亞組，每組6只。（2）主要試劑：Caspase-3和Pdcd-5多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。依達拉奉注射液購自南京先聲藥業(yè)公司，批號040181。

1.2 模型制作 參照李慧等[4]報道的方法，所有大鼠術(shù)前禁食、水，以100 g/L水合氯醛（購于天津市大茂化學(xué)試劑廠，300 mg/kg）腹腔注射麻醉，俯臥位固定于立體定位儀上，正中切開頭皮，以前囟中央為原點，于前囟后1.4 mm，中線向右旁開3.2 mm處用牙科鉆鉆一直徑為1 mm的小孔至顱骨下硬膜，用40℃溫水浸泡鼠尾數(shù)分鐘，消毒后斷尾取自體血50 μL。腦出血組和依達拉奉治療組用微量注射器沿鉆孔方向垂直進針，深約5.6 mm，接著緩慢均速推注50 μL血入腦，注血后留針10 min后緩慢退出，拔除后用醫(yī)用骨蠟封閉骨孔，觀察無出血后，縫合頭皮，加壓包扎尾部。假手術(shù)組除不注射自體血外，余操作同出血組。依達拉奉治療組于腦出血模型制備成功后2 h腹腔內(nèi)注射依達拉奉3 mg/kg，每日1次，用藥到實驗結(jié)束。假手術(shù)組和腦出血組給與等量生理鹽水。模型成功的標準：（1）提尾時大鼠血腫對側(cè)前肢內(nèi)收屈曲。（2）爬行時向血腫對側(cè)傾倒或按逆時針方向轉(zhuǎn)圈。所有大鼠均造模成功。

1.3 腦組織標本制備 術(shù)后在各相應(yīng)時點適量水合氯醛麻醉動物，迅速開胸暴露心臟，從左心室插管至主動脈根部，在右心耳剪開一小口做出口?？焖俚稳?7℃生理鹽水300 mL，無血污后改為滴入固定液4℃多聚甲醛甲醛磷酸鹽緩沖液400 mL。于術(shù)后各時點處死取腦，以血腫為中心按冠狀位切取血腫周圍2 mm的腦組織，固定于4%多聚甲醛溶液中12~24 h，進行脫水透明及石蠟包埋。冠狀面連續(xù)切片，厚度約5 μm，用經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片撈片，晾干后于60℃的烤箱中烘烤備用。

1.4 Caspase-3和Pdcd-5蛋白免疫組化檢測 采用免疫組化SP法嚴格按試劑盒的步驟和要求完成。陽性細胞判定標準：光鏡下Caspase-3和Pdcd-5蛋白以細胞胞質(zhì)呈棕黃色著色為陽性細胞。

1.5 圖像分析 隨機觀察腦出血血腫周圍腦組織不重疊的6個高倍視野（×200），采用高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)IPP（Image pro plus）計數(shù)Caspase-3、Pdcd-5免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)，取其平均值為陽性細胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組均數(shù)比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

假手術(shù)組可見少量散在的Caspase-3和Pdcd-5蛋白陽性細胞表達，由于陽性細胞數(shù)極少，故未進行統(tǒng)計學(xué)檢驗。腦出血組于出血后3 h即有Caspase-3和Pdcd-5陽性細胞表達，12 h明顯增多，1~2 d達高峰，3 d后陽性細胞表達逐漸減少。治療組3 h有陽性細胞表達，隨著出血時間的延長陽性細胞表達逐漸增多，1~2 d達高峰，3 d后開始下降。2組Caspase-3和Pdcd-5蛋白陽性細胞于出血后3 h差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），其余各時點差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或 P<0.01），見表1、2。

Table 1 Comparison of Caspase-3 positive cells in the perihematoma region after intracerebral hemorrhage in different rat groups表1 各觀測點腦出血大鼠血腫周圍組織Caspase-3陽性細胞數(shù)的比較 （n=6，個±s）

Table 1 Comparison of Caspase-3 positive cells in the perihematoma region after intracerebral hemorrhage in different rat groups表1 各觀測點腦出血大鼠血腫周圍組織Caspase-3陽性細胞數(shù)的比較 （n=6，個±s）

*P<0.05，**P<0.01

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Table 2 Comparison of Pdcd-5 positive cells in the perihematoma region after intracerebral hemorrhage in different rat groups表2 各觀測點腦出血大鼠血腫周圍組織Pdcd-5陽性細胞數(shù)的比較 （n=6，個 ±s）

Table 2 Comparison of Pdcd-5 positive cells in the perihematoma region after intracerebral hemorrhage in different rat groups表2 各觀測點腦出血大鼠血腫周圍組織Pdcd-5陽性細胞數(shù)的比較 （n=6，個 ±s）

*P<0.05，**P<0.01

組別腦出血組治療組t 3 h 4.84±0.44 4.16±0.80 1.82 6 h 9.82±0.87 7.15±1.34 4.09**12 h 15.26±1.27 13.46±1.17 2.55*1 d 24.82±1.08 21.52±0.95 5.61**2 d 34.74±2.79 29.84±2.04 3.47**3 d 29.91±1.56 25.80±1.79 4.24**5 d 21.14±1.93 17.77±1.22 3.62**7 d 12.30±0.96 10.45±1.72 2.30*組別腦出血組治療組t

3 討論

細胞凋亡在腦出血繼發(fā)性腦損傷中起重要作用[1]。細胞凋亡過程復(fù)雜，受多種基因及其產(chǎn)物調(diào)控。Caspase是一類天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶，而Caspase-3是Caspase家族最主要的成員之一，是細胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵酶[5]。其可激活特定信號系統(tǒng)，產(chǎn)生核皺縮，造成DNA片段形成等凋亡現(xiàn)象，最終控制著凋亡的發(fā)生和發(fā)展[6]。Pdcd-5基因是由北京大學(xué)人類疾病基因中心從人白血病細胞株TF-1細胞中克隆到的凋亡相關(guān)新基因之一。有研究采用反義封閉和抗體封閉實驗表明，內(nèi)源性的Pdcd-5在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要的正調(diào)控效應(yīng)，它可能作為Caspase-3的正調(diào)控因子參與細胞凋亡[7]。筆者先前研究表明，腦出血大鼠血腫周圍組織存在細胞凋亡，且伴隨Caspase-3和Pdcd-5蛋白表達的變化而改變，Caspase-3和Pdcd-5蛋白可促進腦出血后血腫周圍組織細胞凋亡的發(fā)生[8]。因此，臨床上針對細胞凋亡及凋亡相關(guān)基因的調(diào)控將可能成為治療腦出血的關(guān)鍵步驟。

依達拉奉的化學(xué)結(jié)構(gòu)為3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮,是相對分子質(zhì)量為174.20的親脂性基團，在體內(nèi)以陰離子形式存在，并可轉(zhuǎn)移一個電子給自由基而產(chǎn)生依達拉奉基團，打斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)鏈，進而保護神經(jīng)細胞[9]。有研究表明，依達拉奉可抑制腦出血后血腫周圍組織的細胞凋亡，對出血后腦組織起到神經(jīng)保護作用[10]。本研究結(jié)果顯示，與出血組相比，依達拉奉治療組的Caspase-3和Pdcd-5陽性細胞于出血6 h后各時點表達均有減弱，提示依達拉奉能抑制Caspase-3蛋白和Pdcd-5蛋白的表達，減輕腦損傷，對腦出血后腦組織損傷有保護作用。

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