戎建輝，應(yīng)景艷

(浙江省寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院，浙江 寧波 315100)

原發(fā)性支氣管肺癌是目前人類最常見的惡性腫瘤之一，近20年來其發(fā)病率和病死率的上升幅度在全部惡性腫瘤中位居首位。2003年世界衛(wèi)生組織(WHO)公布全球肺癌發(fā)病率是120萬/年，死亡率是110萬/年，我國城市肺癌發(fā)病率位居常見惡性腫瘤的首位，預(yù)計(jì)到2015年，我國將成為肺癌高發(fā)國［1］。目前對(duì)肺癌的治療主要是手術(shù)治療為主，聯(lián)合放療和化療等綜合治療，但是近年來肺癌5年生存率仍低于10%，其中化療耐藥成為制約肺癌治療效果的主要原因。順鉑是一類細(xì)胞周期非特異性化療藥物，能與腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)合，抑制其DNA的損傷修復(fù)及復(fù)制過程，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，被廣泛應(yīng)用于肺癌的臨床治療［2］。如何增加肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，成為近年來藥理學(xué)與腫瘤學(xué)的研究熱點(diǎn)。多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶［poly adenosine diphoshate(ADP)-ribose polymerase-1，PARP-1］是存在于真核細(xì)胞中催化聚ADP核糖化的細(xì)胞核酶，其參與的聚ADP核糖化是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯后的重要修飾方法之一。PARP-1在DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［3］。體內(nèi)外研究表明，抑制PARP-1可降低DNA修復(fù)功能，增強(qiáng)放化療對(duì)多種腫瘤的治療效果［4］，但目前關(guān)于PARP-1抑制劑對(duì)順鉑在肺癌治療中增敏作用的研究較少。本研究以肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞為研究對(duì)象，從細(xì)胞增殖抑制，DNA、染色體損傷等方面探討經(jīng)典的PARP-1抑制劑4-氨基-1，8-萘二胺(4-Amino-1，8-Naphthalimide，4-AN)對(duì)順鉑的增敏作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

4-AN(純度為99%)，美國Sigma公司;順鉑，齊魯制藥廠;四甲基偶氮唑鹽(MTT)，F(xiàn)luka公司;溴化乙啶(EB)，Amresco公司;DMEM培養(yǎng)基和新生牛血清，Gibco公司。

倒置熒光顯微鏡，Leica;顯微數(shù)碼攝像圖像采集系統(tǒng)，Pixera;DYY-6C型電泳儀和DYCP-34A型電泳槽，北京六一儀器廠;酶標(biāo)儀(Microplate Reader)，Bio-Rad。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞購于上海研晶生物科技有限公司，接種于含10%新生牛血清及100 μg/mL青霉素、鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d傳代1次。

1.3 MTT法檢測(cè)4-AN與順鉑聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞的生長抑制效應(yīng)

取對(duì)數(shù)生長期狀態(tài)良好的A549細(xì)胞以200個(gè)/孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，隨機(jī)分為對(duì)照組與順鉑處理組，分別以含終濃度為0和5 μg/mL順鉑以及不同濃度 4-AN(0，1，2，3，5，10，20，30，50 μmol/L)的DMEM液培養(yǎng)，每個(gè)樣本設(shè)8個(gè)平行孔。24 h后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞3次，加入0.5 mg/mL MTT 溶液 100 μL/孔，37 ℃培養(yǎng) 4 h，棄去含MTT的培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞1次，每孔加入二甲亞砜(DMSO)150 μL，振蕩2 min直到藍(lán)色結(jié)晶完全溶解。用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測(cè)吸光度值(A)值。以4-AN濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，繪制存活率曲線。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞以2×105個(gè)/mL濃度接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，隨機(jī)分為對(duì)照組與順鉑處理組，以含終濃度為0和5 μg/mL順鉑及不同濃度4-AN的DMEM液培養(yǎng)。24 h后，用0.25%胰蛋白酶收獲細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液，以200個(gè)/孔的濃度接種于24孔板，每個(gè)樣本接種3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，更換新鮮的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)10 d，以PBS(pH 7.4)洗滌細(xì)胞 3 次，甲醇固定 20 min，10%Giemsa染色15 min，水沖洗，自然風(fēng)干，于解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)每孔中克隆數(shù)(含50個(gè)細(xì)胞以上的為1個(gè)克隆)，每孔計(jì)數(shù)2次，計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?(各試驗(yàn)組平均克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.5 單細(xì)胞凝膠電泳

對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞用不同濃度的4-AN(0，10，30 μmol/L)及終濃度為 0 和 5 μg/mL 順鉑處理24 h，以0.25%胰酶消化并制成(105～106)/mL的細(xì)胞懸液，分別取細(xì)胞懸液1 mL于1.5 mL離心管中，3 000 r/min離心5 min，棄上清;收獲細(xì)胞并用PBS洗滌細(xì)胞3次，用37℃熔化的0.65%低熔點(diǎn)瓊脂糖900 μL吹打成細(xì)胞懸液，裂解、解旋、電泳、中和;然后用20 μg/mL EB染色。染色后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，以拖尾率(comet rate，每張片子隨機(jī)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)其中彗星細(xì)胞的數(shù)目，算出拖尾細(xì)胞百分率)和Olive尾距(Olive Tail Moment，OTM)作為分析指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，OTM=尾部DNA含量×頭部中心到尾部中心的距離。

1.6 體外微核試驗(yàn)檢測(cè)MMS誘導(dǎo)的染色體斷裂

將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1 mL培養(yǎng)液中含細(xì)胞1×106個(gè)，37℃培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長到對(duì)數(shù)生長期時(shí)，每孔加入不同濃度的 4-AN(0，10，30 μmol/L)以及終濃度為0和5 μg/mL順鉑的 DMEM液，37℃作用24 h后棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌后收獲細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，加入 0.075 mol/L KCl溶液2.5 mL，靜置 5 min，以體積比為 3∶1 的甲醇冰醋酸反復(fù)固定細(xì)胞后制成細(xì)胞懸液0.5 mL，用吖啶橙染色，立即在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。進(jìn)行微核試驗(yàn)，計(jì)算微核細(xì)胞率。微核細(xì)胞率(%)=(微核細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用(x±s)表示，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用單因素方差分析，微核細(xì)胞率采用Possion分布的u檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 4-AN增強(qiáng)順鉑對(duì)A549細(xì)胞的殺傷作用

不同劑量4-AN與順鉑作用后，A549細(xì)胞的生長抑制情況見圖1，在相同濃度順鉑作用下，A549細(xì)胞存活率隨著4-AN濃度的增加而減少，呈明顯劑量反應(yīng)關(guān)系。在順鉑劑量為5 μg/mL的實(shí)驗(yàn)組中，當(dāng)4-AN藥物濃度在1～10 μmol/L時(shí)，A-549細(xì)胞存活率在76% ～92%之間，而當(dāng)4-AN藥物濃度大于10 μmol/L時(shí)，A549細(xì)胞存活率急劇降低，表明4-AN可以劑量依賴的增加順鉑對(duì)A-549細(xì)胞的生長抑制作用。

圖1 4-AN對(duì)順鉑抑制A549細(xì)胞存活率的影響

2.2 克隆形成試驗(yàn)結(jié)果

順鉑與不同濃度4-AN聯(lián)合處理的A549細(xì)胞克隆形成率見表1。結(jié)果顯示，在相同劑量順鉑作用下，A549細(xì)胞克隆形成率均隨4-AN濃度的增加而降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明在所有試驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度，4-AN可增強(qiáng)順鉑對(duì)肺腺癌細(xì)胞的克隆抑制能力。

2.3 4-AN與順鉑聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞的DNA損傷效應(yīng)

表1 4-AN與順鉑作用后A549細(xì)胞的克隆形成率

DNA損傷效應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)，彗星圖見圖2，數(shù)據(jù)見表2。無藥物處理組細(xì)胞核基本呈規(guī)則的原型，較大，亮度較高且均勻，較少出現(xiàn)拖尾，且尾部DNA含量很少。順鉑組與順鉑聯(lián)合4-AN組則出現(xiàn)拖尾，且后者彗星細(xì)胞率及尾部DNA含量均顯著高于前者(P＜0.05)，表明4-AN能增加順鉑造成的DNA損傷。

圖2 4-AN與順鉑聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞DNA損傷的彗星圖(200×)

表2 4-AN與順鉑聯(lián)合作用對(duì)A-549細(xì)胞的DNA損傷效應(yīng)

2.4 4-AN與順鉑聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞的染色體損傷作用

4-AN與順鉑聯(lián)用導(dǎo)致的A549染色體損傷用微核試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表3。順鉑組與順鉑聯(lián)合4-AN組的微核細(xì)胞率均高于無藥物處理組(P＜0.05)。在相同順鉑劑量下，微核細(xì)胞率與4-AN濃度呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系。表明4-AN能增加順鉑造成的染色體損傷，從而增加肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

表3 4-AN與順鉑聯(lián)合作用對(duì)A-549細(xì)胞的染色體損傷效應(yīng)

3 討論

目前肺癌治療的手段為手術(shù)、化療和放療的綜合療法，而我國80%的肺癌患者在臨床確診時(shí)已經(jīng)失去手術(shù)機(jī)會(huì)，代之以化療作為主要的治療手段。順鉑作為一線的肺癌化療藥物，其臨床地位不可替代，但因其耐藥性日益嚴(yán)重。尋求高效低毒的順鉑增敏劑，以提高其化療效果，是藥理學(xué)和腫瘤學(xué)研究的重要內(nèi)容。由于順鉑是一類以腫瘤細(xì)胞DNA為靶點(diǎn)的的化療藥物，因此，針對(duì)參與DNA損傷識(shí)別，反應(yīng)和修復(fù)的分子靶向探索是目前順鉑增敏的主要研究方向。

PARP-1在DNA損傷修復(fù)，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的調(diào)節(jié)與細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)的異常可能擾亂正常的DNA修復(fù)功能，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明淋巴瘤細(xì)胞中的PARP-1基因表達(dá)較正常淋巴細(xì)胞增強(qiáng)，且肝癌細(xì)胞中PARP-1活性增加且與癌細(xì)胞分化程度相關(guān)［5］，而抑制PARP-1則可降低DNA修復(fù)功能，增強(qiáng)化療對(duì)腫瘤的治療效果［4］。4-AN是一類新型的PARP-1抑制劑，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有放射增敏作用［6］。本研究以人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞為研究對(duì)象，從癌細(xì)胞生長抑制，DNA、染色體損傷等方面，探討4-AN對(duì)順鉑在治療肺腺癌細(xì)胞中的增敏作用和相關(guān)機(jī)制研究。

常用的測(cè)定體外培養(yǎng)細(xì)胞化療增敏性的實(shí)驗(yàn)分為細(xì)胞毒性試驗(yàn)和遺傳毒性試驗(yàn)兩類。細(xì)胞毒性試驗(yàn)主要有人工血球計(jì)數(shù)法、臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)法、3H-TDR參入法、羅丹染色法和MTT比色法和克隆形成實(shí)驗(yàn)等［7］。腫瘤細(xì)胞的特征是具有自我更新和增殖能力，可分化和形成克隆，相對(duì)克隆形成率和克隆形成抑制率是判斷外源性化合物細(xì)胞毒性效應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn)，因此，克隆形成試驗(yàn)也被廣泛應(yīng)用于化療藥物敏感性的測(cè)定。本研究采用MTT法和克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)4-AN與順鉑聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)。結(jié)果顯示，在相同濃度順鉑作用下，A-549細(xì)胞存活率及克隆形成率均隨著4-AN濃度的增加而減少，呈明顯劑量反應(yīng)關(guān)系，提示4-AN可以濃度依賴得增加順鉑對(duì)A549細(xì)胞的殺傷作用。

DNA是順鉑作用的重要靶分子之一。DNA單雙鏈斷裂是順鉑造成的DNA損傷中較常見的形式，且其損傷的修復(fù)是一個(gè)關(guān)系細(xì)胞最終轉(zhuǎn)歸的極為重要的過程。以往研究證明，腫瘤細(xì)胞DNA單雙鏈修復(fù)能力較強(qiáng)是其耐藥的主要機(jī)制之一［8］，若腫瘤細(xì)胞的DNA損傷不能被及時(shí)修復(fù)，則DNA損傷將逐漸累積造成不可逆的染色體損傷，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。彗星試驗(yàn)(comet assay)也稱單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)，是目前檢測(cè)DNA損傷最敏感的方法之一，不僅可以檢測(cè)DNA單雙鏈的斷裂、DNA交聯(lián)，還可以檢測(cè)DNA損傷的修復(fù)情況［9］。微核試驗(yàn)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種快速檢測(cè)多種染色體異常的短期致突變?cè)囼?yàn)［10］。本研究采用兩種不同遺傳學(xué)終點(diǎn)的經(jīng)典遺傳毒性試驗(yàn)-單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)和微核試驗(yàn)檢測(cè)4-AN與順鉑聯(lián)合作用后A549細(xì)胞的DNA及染色體損傷情況，試驗(yàn)結(jié)果均顯示4-AN能增加順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的遺傳損傷，提示4-AN具有順鉑增敏的作用。綜合上述細(xì)胞毒性試驗(yàn)和遺傳毒性試驗(yàn)的結(jié)果，我們推斷，順鉑是一種二價(jià)鉑同兩個(gè)氯原子和兩個(gè)氨分子結(jié)合的重金屬絡(luò)合物，類似于雙功能烷化劑，以腫瘤細(xì)胞DNA為靶點(diǎn)，其引起的以DNA單雙鏈為主的DNA損傷是其化療的主要作用機(jī)制。PARP-1的鋅指結(jié)構(gòu)域可識(shí)別結(jié)合于DNA單鏈斷裂，切割NAD+，將眾多腺苷二磷酸核糖單位連接至目標(biāo)蛋白，最終可致高負(fù)性蛋白的形成，繼而可通過堿基切除修復(fù)途徑松解并修復(fù)損傷的DNA。而施以PARP抑制劑后可阻止此種修復(fù)過程，加劇DNA損傷，引起不可逆的染色體斷裂，最終導(dǎo)致肺腺癌細(xì)胞死亡，表現(xiàn)為細(xì)胞生長和克隆形成受抑。

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