周珊珊，許宗斌，魯 偉

(貴陽市肺科醫(yī)院 藥劑科，貴州 貴陽 550003)

卵巢癌是一種常見的婦科腫瘤，盡管發(fā)病率位于子宮癌之后，但死亡率居于婦科腫瘤首位，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生育能力［1］。除手術(shù)切除外，化療是常用的治療手段，但長期使用毒副作用大，因此需探討有效的治療方法［2］。狼毒大戟是一種含二萜醇類化合物，對(duì)多種惡性腫瘤有較好的治療效果，如肺癌、胃癌及肝癌等，且未發(fā)現(xiàn)長期化療的不良反應(yīng)［3-4］。巖大戟內(nèi)酯 B(Jolkinolide B，JB)是狼毒大戟的主要成分［5］，研究表明其可通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路來誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡［6］。提示JB可用于惡性腫瘤的治療。但目前對(duì)JB能否抑制卵巢癌的研究較少，因此本研究給予人卵巢癌Skov3細(xì)胞JB處理，觀察對(duì)其增殖的影響，為臨床卵巢癌的治療提供依據(jù)。

1 材料

JB(純度≥98%)，上海惠誠生物科技有限公司;LY294002(PI3K抑制劑)，美國Sigma公司;人卵巢癌Skov3細(xì)胞，美國ATCC;二甲亞砜(DMSO)、TritonX100、胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶，美國 Gibco公司;β-actin、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記鼠二抗、兔二抗單克隆抗體，美國Santa Cruz 公司;Akt、P-Akt(Ser473)、Bax、Caspase-3 和Bcl-2多克隆抗體，美國Cell Sigaling Technology公司;其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 細(xì)胞傳代培養(yǎng)

將人卵巢癌Skov3細(xì)胞接種于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基60 mL中。培養(yǎng)2～3 d后，置于倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞形態(tài)為致密單層時(shí)，移除培養(yǎng)基并用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞3次，用37℃預(yù)熱的0.25%胰酶消化細(xì)胞1 min左右，待細(xì)胞呈現(xiàn)圓形時(shí)，加入少量RPMI 1640培養(yǎng)基終止消化，1 500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，并采用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按5×105/mL將卵巢癌Skov3細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2下培養(yǎng)。

2.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率

以5×104/mL將Skov3細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板(100 μL/孔)，采用不含血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基稀釋 JB 分別至 0.1，1.0，5.0，10.0，20.0，50.0 μmol/L，每組設(shè)6個(gè)平行樣本，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組(不加藥);培養(yǎng)72 h后向每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，孵育4 h后終止培養(yǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)量在490 nm波長處的吸光度(A)值，重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。增殖抑制率 =［1－(A實(shí)驗(yàn)組/A陰性對(duì)照組)］×100%。

2.3 細(xì)胞凋亡指數(shù)

將小玻片(高壓滅菌處理)預(yù)先置于培養(yǎng)板底部，將Skov3單細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后棄掉培養(yǎng)基，并加入不加藥培養(yǎng)基(對(duì)照組)、含 20.0 μmol/L JB 培養(yǎng)基(JB 組)、含 30.0 μmol/L LY294002 培養(yǎng)基(LY294002 組)和含 20.0 μmol/L JB+20.0 μmol/L LY294002 培 養(yǎng) 基 (JB+LY294002組)，處理24 h后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞爬片，PBS沖洗 3次后，加入 5 μg/mL Hoechst 33342染色，室溫下反應(yīng)30 min后采用熒光顯微鏡觀察形態(tài)，于每組隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

2.4 全蛋白提取

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞并用預(yù)冷的PBS清洗3次，吸干后加入全蛋白提取緩沖液0.5 mL，于冰上裂解15 min;在多次刮取細(xì)胞后通過吹打使細(xì)胞懸浮，轉(zhuǎn)移至EP管中，冰上振蕩處理15 min;12 000 r/min離心20 min，采用BCA法測(cè)定上清液的蛋白濃度，并將蛋白置于－70℃保存。

2.5 Western blot實(shí)驗(yàn)

將蛋白樣品與加樣緩沖液混合，煮沸(100℃ ×5 min)后離心3 min，取等量蛋白加樣后進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳。電泳條件:濃縮膠恒壓80 V約20 min，分離膠100 V約80 min。半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，按約0.1 mL/cm2的量加適量一抗，Akt、P-Akt(Ser473)的稀釋比例為 1∶200，Bax、Caspase-3和Bcl-2caspase-3的稀釋比例1∶400。4℃孵育過夜。PBST漂洗PVDF膜，加入二抗(稀釋比例1∶3 000)室溫下?lián)u蕩孵育2 h，然后用PBST充分洗膜。采用ECL法來顯色處理，膠片曝光后觀察蛋白的條帶，并采用Gel-Pro analyzer分析各顯影條帶的光密度。除P-Akt(Ser473)的相對(duì)光密度表示為P-Akt/Akt外，其余均表示為與β-actin的比值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以(x±s)表示，多組之間比較采用單因素方差分析(one way ANOVA)，兩組之間比較采用成組t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 JB處理對(duì)人卵巢癌Skov3細(xì)胞增殖的影響

分別給予 Skov3細(xì)胞0.1～50.0 μmol/L 的 JB處理均可抑制Skov3細(xì)胞的增殖，且抑制率呈劑量依賴的方式升高，IC50為 5.28 μmol/L，見圖 1。

圖1 不同濃度JB對(duì)Skov3細(xì)胞的增殖抑制率Fig.1 The proliferation inhibition rates of Skov3 cell treated by different concentrations of JB

3.2 JB處理對(duì)人卵巢癌Skov3凋亡的影響

20.0 μmol/L JB、30 μmol/L LY294002(PI3K 抑制劑)處理Skov3細(xì)胞后的凋亡指數(shù)分別為(42.65±5.83)% 和(13.37 ±2.67)%，均高于對(duì)照組的(0.77±0.11)%;LY294002可增加 JB 誘導(dǎo) Skov3細(xì)胞凋亡的作用，凋亡指數(shù)為(54.61±7.09)%，且與對(duì)照組、JB組和LY294002組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。Hoechst染色圖見圖 2。

圖2 不同藥物處理Skov3細(xì)胞后的凋亡圖Fig.2 The original apoptotic recording of Skov3 cell treated by different reagents

3.3 JB處理對(duì)人卵巢癌Skov3細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路影響

JB刺激后，Akt的Ser473磷酸化位點(diǎn)被抑制，且P-Akt(Ser473)/Akt降低;而LY294002也可降低P-Akt(Ser473)/Akt水平，同時(shí)可增強(qiáng)JB抑制Akt的Ser473磷酸化位點(diǎn)的激活，均與對(duì)照組有顯著差異(P＜0.05)，且各組處理對(duì)Akt蛋白總量無影響，見圖3～4。

3.4 JB處理對(duì)人卵巢癌Skov3細(xì)胞Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白水平的影響

JB處理可增加促凋亡基因(Bax、Caspase-3)的蛋白水平，降低抑制凋亡基因(Bcl-2)的蛋白水平，與對(duì)照組和LY294002組有差異;而LY294002可增強(qiáng)JB增高Bax、Caspase-3蛋白水平和降低Bcl-2蛋白水平的作用，且與JB組有差異，見圖3～4。

圖3 不同藥物處理對(duì)Skov3細(xì)胞各蛋白的影響(Western blot)Fig.3 The influence on different proteins of Skov3 cell treated by different reagents(Western blot)

圖4 不同藥物處理對(duì)Skov3細(xì)胞各蛋白相對(duì)光密度的影響Fig.4 The influence on the relative optical density of different proteins of Skov3 cell treated by different reagents

4 討論

JB具有多種生物活性，如誘導(dǎo)乳腺癌MDAMB-231、人類白血病U937細(xì)胞凋亡，抑制炎癥反應(yīng)等［7-8］，而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)JB對(duì)裸鼠移植MCF-7乳腺癌有較好的抗腫瘤作用［9］，提示JB具有抗腫瘤的效果。

本研究采用JB刺激卵巢癌Skov3細(xì)胞發(fā)現(xiàn)可呈劑量依賴的方式抑制細(xì)胞增殖，具體表現(xiàn)在其可升高Skov3細(xì)胞的增殖抑制率，提示JB可抑制卵巢癌Skov3細(xì)胞的增殖。此外，給予20 μmol/L的JB還可誘導(dǎo)Skov3細(xì)胞的凋亡，表現(xiàn)為Hoechst陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞的比例高于對(duì)照組，這與Lin等［6］發(fā)現(xiàn)的JB可誘導(dǎo)MDA-MB-231的結(jié)論一致，表明JB對(duì)卵巢癌Skov3細(xì)胞有較好的抗腫瘤效果。

以往的研究表明，大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞PI3K/Akt通路是激活的，且在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡中發(fā)揮重要作用［10］，而相關(guān)研究提示JB可通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［7-8］，因此推測(cè)其也可能通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路來發(fā)揮抗腫瘤的作用。Akt(Ser473)磷酸化位點(diǎn)的激活狀態(tài)是評(píng)價(jià)PI3K/Akt信號(hào)通路的常用手段［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，JB可導(dǎo)致Akt(Ser473)水平降低，表明其可抑制Akt(Ser473)磷酸化位點(diǎn)的活化，這與Lin和Wang的研究［6-7］一致。JB誘導(dǎo)Skov3細(xì)胞增殖的效果要強(qiáng)于對(duì)照組和使用PI3K抑制劑(LY294002)的效應(yīng)，提示JB除抑制PI13K/Akt信號(hào)通路外，還可能有其他機(jī)制。

死亡受體途徑是細(xì)胞凋亡主要途徑，當(dāng)外界刺激導(dǎo)致死亡受體的表達(dá)失衡時(shí)，即可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如促凋亡基因表達(dá)上調(diào)，抑制凋亡基因表達(dá)下調(diào)等［12-13］。本研究分析JB處理后對(duì)常見的促凋亡基因(Bax、Caspase-3)和抑制凋亡基因(Bcl-2)蛋白水平的影響，發(fā)現(xiàn)其可上調(diào)Bax、Caspase-3的蛋白水平，降低Bcl-2的蛋白水平，表明JB可激活Skov3細(xì)胞的死亡受體途徑。

綜上所述，大戟內(nèi)酯B可抑制人卵巢癌Skov3細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能是通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路和誘導(dǎo)死亡受體表達(dá)來發(fā)揮抗腫瘤作用的。

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