李茹冰，李若冰，王翠玲，張宜俊，李 超，傅泳航

(1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院 藥劑科，廣東 廣州 510010;2.廣東省人民醫(yī)院 心外科，廣東 廣州 510000;3.廣州市愷泰生物科技有限公司，廣東 廣州 510620;4.解放軍第四五八醫(yī)院 檢驗科，廣東 廣州 510600)

白細胞介素-12(IL-12)是由35 kD的輕鏈和40 kD的重鏈組成的異源性二聚糖蛋白，由抗原遞呈細胞在受到刺激后分泌。IL-12可啟動細胞介導免疫，活化T細胞和NK細胞，增加Th1細胞數(shù)量，使其在細胞中占絕對優(yōu)勢，增強CD8+T細胞的細胞毒性［1］，并抑制Th2型細胞免疫，是形成特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答的樞紐因子［2］，已經(jīng)在不同模型動物的腫瘤和傳染性疾病的治療上顯示出潛質(zhì)［3-4］。傅泳航等［5］研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)聯(lián)合重組鼠白細胞介素-12(rmIL-12)可明顯增強免疫小鼠脾細胞分泌 γ-干擾素(IFN-γ)的水平，表明IL-12對于乙肝疫苗具有免疫增強作用，且導向Th1型免疫應答。吳長有等［6］發(fā)現(xiàn)，重組人白細胞介素-12(rhIL-12)促使慢性HBV攜帶者外周血單核細胞(PBMC)產(chǎn)生HBV特異的中樞記憶性CD8+T淋巴細胞的免疫應答，顯示其在臨床應用方面具有較好的發(fā)展?jié)摿?。本文對rhIL-12刺激健康人PBMC產(chǎn)生IFN-γ的細胞來源及對IL-12R的影響進行了研究。

1 材料

1.1 受試者

健康人8例，均曾接種過乙肝疫苗，HBV血清學指標如下:HBsAg(－)、抗 HBs(+)、HBeAg(－)、抗Be(－)、抗 HBc(－)。

1.2 試劑

rhIL－12(批號20080611)，廣州市愷泰生物科技有限公司;重組HBsAg(rHBsAg)疫苗，深圳康泰生物制品股份有限公司;RPMI 1640、Hanks'液和胎牛血清，美國GIBCO公司;Ficoll淋巴細胞分離液，上海華精公司;人 IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)試劑盒、TMB底物顯色劑、CD3PE、CD8FITC、CD4PreCP、CD3FITC、CD56PE、IFN-γ、APC(別藻藍蛋白，Allophycocyanin)、CD212(IL-12Rβ1)PE、CD212(IL-12Rβ2)PE、CD8 FITC(異硫氰酸熒光素)、CD4 APC、CD56PE-CY5，美國 BD 公司。

1.3 儀器

MultiskanMK3酶標儀，上海精科實業(yè)有限公司;FACS Calibur流式細胞儀，美國BD公司。

2 方法

2.1 人PBMC的分離

抽取8名健康志愿者靜脈血10 mL，肝素抗凝。Hanks'液等體積稀釋，用Ficoll進行密度梯度離心，8℃，2 000 r/min(離心半徑18 cm)離心20 min，獲取PBMC，充分洗滌后，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整PBMC濃度為2 ×106/mL，備用。

2.2 體外誘導正常人PBMC產(chǎn)生IFN-γ

分組如下:(1)陰性對照組:培養(yǎng)液;(2)rHBsAg組:500 ng/mL;(3)rhIL-12 組:1.0 ng/mL;(4)聯(lián)合組:500 ng/mL rHBsAg+1.0 ng/mL rhIL-12。

細胞培養(yǎng)板每孔中含細胞懸液及相應濃度刺激物各100 μL，各刺激物濃度均設(shè)6個復孔，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，ELISA測定培養(yǎng)上清中IFN-γ的濃度。

2.3 IFN-γ 的細胞來源測定

PBMC細胞分別加入4管15 mL細胞離心管中，每管1 mL，分組同2.2項。37℃，5%CO2溫育24 h;溫育至最后2 h加蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑(BFA)10 μL/mL，混勻。細胞用 pH 7.2，0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次(1 000 r/min，5 min)，用紙吸干后加固定液，每管各加4%PFA(多聚甲醛)2 mL，混勻，常溫放置8 min;用PBS洗2次(2 000 r/min，10 min)，用紙吸干，各加破膜劑400 μL，4 ℃過夜;染色:每管兩個組合，每組200 μL細胞。一組加入PE標記的CD3抗體、PreCP標記的CD4抗體、FITC標記的CD8抗體、APC標記的IFN-γ抗體;另一組加入FITC標記的CD3抗體、PE標記的CD56抗體、APC標記的IFN-γ抗體。每種抗體加入量均為2 μL。4℃，避光30 min后用破膜劑洗2次;每管各加含0.1%BSA(牛血清白蛋白)的 PBS 300 μL，重懸細胞，采用流式細胞術(shù)檢測CD4+IFN-γ+T細胞、CD8+IFN-γ+T細胞及CD56+IFN-γ+NK 細胞百分比。

2.4 細胞表面IL-12R測定

PBMC細胞分別加入4管15 mL細胞離心管中，每管1 mL，分組同2.2項。37℃，5%CO2分別溫育72 h，細胞用PBS洗2次(1 000 r/min，5 min)，各加PBS 400 μL重懸細胞，染色:每管兩個組合，一組加 PE標記的 CD212(IL-12Rβ1)、FITC標記的CD8、PE-CY5標記的 CD56、APC標記的 CD4;另一組加 PE標記的 CD212(IL-12Rβ2)、FITC標記的CD8、PE-CY5標記的CD56、APC標記的CD4。每組200 μL細胞，混勻染色30 min后用 PBS洗 2次(2 000 r/min，5 min)，用含 0.1%BSA 的 PBS 300 μL重懸細胞，采用流式細胞術(shù)分別測定CD4+、CD8+、CD56+細胞表面 IL-12Rβ1、IL-12Rβ2。

2.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用(x±s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行重復測量方差分析，顯著性水準為α=0.05，以P＜0.05為具有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 體外刺激PBMC產(chǎn)生特異性IFN-γ

用500 ng/mL rHBsAg或1.0 ng/mL rhIL-12單獨刺激人PBMC時，發(fā)現(xiàn)僅有少量IFN-γ產(chǎn)生，而用HBsAg聯(lián)合rhIL-12刺激時，發(fā)現(xiàn)所有人PMBC都能產(chǎn)生IFN-γ，而且 IFN-γ的平均水平顯著高于單獨使用rHBsAg組和rhIL-12組(P＜0.05)，見表1。

3.2 IFN-γ 的細胞來源

rhIL-12組CD8+IFN-γ+T細胞及CD56+IFN-γ+NK細胞百分比與對照組比較均有明顯升高(P＜0.05);rHBsAg組各細胞百分率升高不如rhIL-12組，與對照組比較無顯著差異(P＞0.05);rhIL-12與rHBsAg聯(lián)合組CD8+IFNγ+T細胞及CD56+IFN-γ+NK細胞百分比均較對照組明顯升高(P＜0.01)，其中 CD56+IFN-γ +NK 細胞與 rHBsAg組比較均有顯著差異(P＜0.05)，見表2。

表1 rhIL-12單獨及與HBsAg聯(lián)合對人PBMC產(chǎn)生IFN-γ影響(x±s)Tab.1 The comparison of IFN-γ induced by rhIL-12 alone and combined with rHBsAg in PBMC from the healthy(x±s)

表2 人PBMC與rhIL-12及rHBsAg孵育后IFN-γ+細胞百分數(shù)(x±s)Tab.2 The percentage of IFN-γ +cells in PBMC incubated with rhIL-12，rHBsAg and rhIL-12+rHBsAg(x±s)

3.3 PBMC細胞表面IL-12R增加

未經(jīng)外源因子刺激的PBMC細胞表面IL-12R表達為對照組基礎(chǔ)值，IL-12Rβ1和 IL-12Rβ2在健康人的表達水平無明顯差異。

rhIL-12組表達 IL-12Rβ1和 IL-12Rβ2的各細胞亞群均有不同程度升高，且CD8+IL-12Rβ2和CD56+IL-12Rβ1上調(diào)幅度尤其明顯，與對照組比較均有非常顯著差異(P＜0.01)。

rHBsAg組細胞受體增加幅度大于rhIL-12組，其中CD56+IL-12Rβ1升高較之有非常顯著意義(P＜0.01)。與對照組比較，CD4+IL-12Rβ1和 CD8+IL-12Rβ1、CD4+IL-12Rβ2 和 CD56+IL-12Rβ2均升高明顯(P＜0.05);CD56+IL-12Rβ1和 CD8+IL-12Rβ2升高非常顯著(P ＜0.01)。

rhIL-12與rHBsAg聯(lián)合組β1和β2受體表達增加，與對照組比較均有顯著差異(P＜0.01或0.01)，但CD4+IL-12Rβ2除外。聯(lián)合組增加幅度大多明顯高于單用rhIL-12或rHBsAg組，其中CD8+IL-12Rβ1和 CD56+IL-12Rβ1與單用 rhIL-12或 rHB-sAg組比較均有顯著差異(P＜0.05或0.01)。

這表明rhIL-12和rHBsAg單獨均能上調(diào)健康人PBMC表面IL-12R的表達，且rhIL-12聯(lián)合rHB-sAg有增強作用，見表3。

4 討論

HBsAg主要誘導體液免疫應答，如能使抗原特異性應答向Th1方向分化，并產(chǎn)生有效的CTL反應，對于乙型肝炎的預防和治療均具有重要意義［7］。IL-12是一種能特異性增強Th1和CTL功能的細胞因子，在動物實驗及臨床觀察中，均表現(xiàn)出較強的抑制病毒復制的作用。同時，IL-12也是一種有潛力的細胞免疫反應佐劑［8］。慢性乙肝患者特別是高HBV復制者IL-12的分泌及其免疫調(diào)節(jié)作用受到損害，CTL數(shù)量不足及功能低下與IL-12密切相關(guān)。IFN-γ主要由NK細胞和某些 T亞群包括NKT、CD8+T及 γ δ T細胞產(chǎn)生，Mφ、DC 和 B 細胞也能分泌IFN-γ［9］。IL-12通過誘生內(nèi)源性IFN-γ，促進Th1細胞亞群發(fā)育，是IL-12抗HBV作用重要機制之一。因此，IL-12很可能在慢性乙肝的預防和治療中起到積極作用。

表3 人PBMCs經(jīng)刺激后各細胞亞群表達IL-12R的細胞百分數(shù)(x±s)Tab.3 The percentage of cell subgroup expressing IL-12R in PBMC stimulated by rhIL-12，rHBsAg and rhIL-12+rHBsAg(x±s)

rHBsAg或rhIL-12單獨刺激健康人PBMC，僅產(chǎn)生少量IFN-γ，二者聯(lián)合刺激產(chǎn)生 IFN-γ平均水平顯著高于單用組。rhIL-12組CD8+IFN-γ+T細胞及CD56+IFN-γ+NK細胞百分比較對照組明顯升高;rHBsAg組各細胞百分率升高不如rhIL-12組，聯(lián)合組CD8+IFN-γ+T細胞及CD56+IFN-γ+NK細胞百分比均較對照組明顯升高，其中CD56+IFN-γ+NK細胞與rHBsAg組比較均有顯著差異，提示rhIL-12誘生的 IFN-γ主要來自CD56+NK細胞、CD8+T細胞，其次是CD4+T細胞，rhIL-12與rHB-sAg聯(lián)合具有增強作用。

IL-12的生物學活性具有專一性，必須由高親合力的IL-12R來介導。IL-12對于自身受體的調(diào)節(jié)起著非常重要的作用。未致敏Th細胞不表達 IL-12Rβ2，當抗原與 TCR 結(jié)合后，IL-12Rβ2低水平表達，有IL-12存在時，功能性IL-12R表達大大增加。因而IL-12和IL-12R結(jié)合后通過復雜的信號轉(zhuǎn)導途徑，促進Th1或NK細胞的活化，而發(fā)揮其生物學功能。本研究結(jié)果表明，rhIL-12組表達β1和β2受體的各細胞亞群均有不同程度升高，且 CD8+IL-12Rβ2和CD56+IL-12Rβ1上調(diào)幅度尤其明顯，rHBsAg組增加幅度大于rhIL-12組，聯(lián)合組β1和β2受體表達增加幅度大多明顯高于單用組，表明rhIL-12和rHBsAg單獨均能上調(diào)健康人PBMC表面IL-12R的表達，且rhIL-12聯(lián)合rHBsAg有增強作用。研究顯示，rhIL-12對CD4+T細胞、CD8+T細胞和CD56+NK細胞表面表達IL-12Rβ1和IL-12Rβ2起著非常重要的作用，rhIL-12與rHBsAg聯(lián)合組對受體表達的影響明顯高于單用rhIL-12或rHBsAg組。這表明rhIL-12和rHBsAg單獨均能上調(diào)健康人PBMC表面IL-12受體的表達，且rhIL-12聯(lián)合rHBsAg有增強作用。

上述結(jié)果顯示，rhIL-12與rHBsAg聯(lián)合主要通過誘導 T細胞和 NK細胞大量分泌 IFN-γ，調(diào)節(jié)Th1/Th2，上調(diào)IL-12受體的表達來促進免疫應答，進而達到抑制HBV復制或者清除HBV。

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