江 薇，李雪竹，嚴海東

(同濟大學附屬東方醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 20120)

環(huán)孢菌素A(Cyclosporin A，CsA)是一種由親脂性不完全真菌Tolypocladium inflatum Gams在生長過程中產(chǎn)生的多肽混合物，是自然界25種環(huán)孢素中免疫抑制活性最強的一種。CsA應(yīng)用于器官移植后的抗排斥反應(yīng)，使器官移植的預后得到了極大改觀［1-2］。近年來，CsA還用于難治性腎病綜合征的治療，取得了良好的效果。但CsA的一些嚴重不良反應(yīng)尤其是腎間質(zhì)纖維化的慢性腎毒性限制了該藥的應(yīng)用［1］。研究發(fā)現(xiàn)，CsA誘導氧化應(yīng)激產(chǎn)生過多的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是CsA慢性腎毒性發(fā)病機制之一［1］。銀杏葉標準提取物(Ginkgo biloba extract，EGb)具有抗氧化作用，我們以前的研究發(fā)現(xiàn)其具有減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕纖維化，具有腎臟保護作用［3］，但EGb對于CsA慢性腎損傷的作用機制尚不清楚。本實驗建立CsA慢性腎損傷動物模型，觀察腎小管間質(zhì)細胞凋亡、細胞周期蛋白p27的表達及EGb對其的影響，以期為尋找有效的防治CsA腎毒性的藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器

雄性Wistar大鼠20只，體質(zhì)量200～230 g，購自并飼養(yǎng)于復旦大學醫(yī)學院實驗動物中心(SPF級)。CsA購自瑞士諾華公司，EGb(含黃酮甙24.1%，銀杏苦內(nèi)酯9.1%)由上海信誼百路達藥業(yè)有限公司提供。細胞凋亡檢測試劑盒I(POD)購自武漢博士德生物公司，兔抗大鼠p27多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔第二抗體、3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購自洛陽華美公司。UV-2102 PCS型紫外可見分光光度儀(德國Unicon)，低溫高速離心機(美國Beckman)，光學顯微鏡(日本Olympus)。

1.2 CsA慢性腎毒性模型的建立及分組

選用雄性 Wistar大鼠20只，體質(zhì)量 200～230 g，飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持在(20±2)℃，相對濕度(40% ～60%)，光照12 h，自由進食、飲水，大鼠適應(yīng)性正常飼養(yǎng)1周。隨機分為5組:(1)對照組:4只，予CsA溶劑(橄欖油)皮下注射;(2)小劑量CsA模型組:4只，CsA以橄欖油稀釋，按每日25 mg/kg皮下注射;(3)大劑量CsA模型組:4只，CsA按每日50 mg/kg劑量皮下注射;(4)小劑量CsA+EGb治療組:4只，每日25 mg/kg CsA皮下注射同時，予EGb每日(300 mg/kg，用生理鹽水配制成4%的懸濁液)灌胃;(5)大劑量CsA+EGb治療組:4只，每日50 mg/kg CsA皮下注射同時，予EGb每日(300 mg/kg，用生理鹽水配制成4%的懸濁液)灌胃。以上各組分別給藥4周，實驗結(jié)束時處死動物，收集24 h尿，動物處死前禁食12 h，準確稱取體重。動物處死后腹主動脈取血5 ml，取血清采用羅氏Modular P800全自動生化分析儀檢測血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、尿蛋白、尿肌酐，計算24 h尿蛋白定量。雙腎分離后，左腎剝?nèi)グぶ糜?%多聚甲醛緩沖液固定，制作石蠟切片;右腎置于液氮中保存，用于制備腎組織勻漿液。

1.3 Masson染色觀察腎組織病理改變

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，采用Masson三色染色法觀察腎小管間質(zhì)纖維化情況。200×鏡下每張切片采集30個不重復視野，用北航醫(yī)學病理圖像分析軟件自動分析系統(tǒng)根據(jù)病變的百分數(shù)判定積分:0為無病變;0.5為＜5%(每視野);1為5%;1.5為16%;2為26%;2.5為36% ～45%;3為＞45%。將呈現(xiàn)為藍色的區(qū)域作為陽性目標，以陽性面積與統(tǒng)計總面積的比值作為腎小管間質(zhì)纖維化的評分標準。

1.4 免疫組化觀察腎臟p27表達水平

腎組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，1.5%H2O2－甲醇去除組織中的內(nèi)源性過氧化物酶，微波消化修復抗原，滴加1%BSA封閉，滴加兔抗大鼠p27第一抗體(1∶100稀釋);以1%BSA替代一抗作空白對照，4℃過夜，滴加辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(抗兔，1∶200)，DAB顯色。每張切片在200×光鏡下隨機選取30個不重復的視野，計數(shù)p27陽性細胞數(shù)，結(jié)果以陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)的百分比表示。

1.5 腎組織細胞凋亡檢測

采用Tunel方法，操作步驟按說明書介紹進行。TUNEL標記的陽性細胞為核著黃色或棕黃色為凋亡細胞。在低倍鏡(10×10)下隨機選取至少30個不重復的視野，計數(shù)凋亡陽性細胞數(shù)，結(jié)果以陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)的百分比表示。

1.6 統(tǒng)計學處理

用SPSS12.0軟件對結(jié)果中的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組體質(zhì)量、尿量、腎功能及尿蛋白水平

如表一所示，與對照組相比，所有CsA模型組和EGb治療組體質(zhì)量均明顯下降(P＜0.05)，CsA大劑量(50 mg)+EGb治療組體質(zhì)量較CsA大劑量(50 mg)模型組明顯增加(P＜0.05)。同樣，與對照組相比，所有CsA模型組和EGb治療組動物24 h尿蛋白定量均明顯增加(P＜0.05)，而EGb治療后可明顯降低尿蛋白水平(P＞0.05)，但CsA小劑量模型組與大劑量模型組間無顯著性差異(P＞0.05)。其他各項指標包括尿量和Scr和BUN水平，與對照組相比，所有CsA模型組和EGb治療組均明顯增加(P＜0.05)，但CsA模型組和EGb治療組之間無明顯差異(P＞0.05)，見表1。

表1 各組體質(zhì)量、尿量、腎功能及尿蛋白水平Tab.1 Body weight，urine volume，renal function and urinary protein in 24 h in each group

2.2 各組腎臟組織學改變

Masson染色顯示，CsA處理大鼠后，腎小管上皮細胞充血腫脹，腎小管上皮細胞變性、壞死，可見蛋白管型;間質(zhì)炎癥反應(yīng)，間質(zhì)細胞增生，間質(zhì)纖維化評分明顯增高(P＜0.05)，CsA大劑量組較小劑量組病變加重。而以上改變在EGb組中有不同程度減輕。見圖1、表2。

表2 各組腎間質(zhì)纖維化評分Tab.2 Score of renal interstitial fibrosis in each group

2.3 各組腎組織中細胞凋亡情況

正常對照組腎組織中凋亡細胞非常少見，而在所有CsA模型組和EGb治療組腎組織中可見大量的核深染，呈棕色的凋亡細胞，較正常對照組明顯增高(P＜0.05)，其中CsA大劑量模型組凋亡細胞百分比較CsA小劑量模型組明顯升高(P＜0.05)，而EGb治療組凋亡細胞百分比較CsA模型組明顯下降(P＜0.05)，見圖2、表 3。

表3 各組凋亡細胞百分比及p27陽性細胞百分比Tab.3 Percentage of cell apoptosis and p27 expression in renal tissues

2.4 各組腎組織中p27表達情況

與正常對照組相比，所有CsA模型組和EGb治療組腎組織中p27陽性細胞百分比明顯增加(P＜0.05)，其中CsA大劑量模型組較CsA小劑量模型組明顯升高(P＜0.05)，而EGb治療組p27陽性細胞百分比則較CsA模型組明顯減少(P＜0.05)。見圖3。此外，p27陽性細胞百分比與凋亡陽性細胞百分比呈明顯正相關(guān)(R=0.9594，P＜0.05)。見表 3、圖4。

3 討 論

CsA是器官移植和治療某些自身免疫性疾病的免疫抑制劑。但過量和長期應(yīng)用可導致腎間質(zhì)條狀纖維化，腎小管萎縮，腎小球動脈透明樣變性等腎損傷，研究發(fā)現(xiàn)近30%的CsA使用者會出現(xiàn)中度或重度腎毒性［4-5］。雖然CsA引起腎毒性的機制尚不完全清楚，但可能與激活腎素-血管緊張素(reninangiotensin system，RAS)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、腎細胞凋亡、血管活性介質(zhì)如血栓素A2(Thromboxane，A2)與白三烯(Leukotriene)、活性氧等有關(guān)［6］。

本研究中CsA模型組和EGb治療組尿蛋白均明顯增加，雖然小劑量模型組Scr較對照組升高，而大劑量模型組較對照組無改變，分析其原因可能為血Scr與肌肉含量有關(guān)，大劑量模型組體重減輕明顯，故血肌酐無明顯上升，而CsA模型組和EGb治療組Ccr均下降;組織學上可見腎小管充血腫脹，腎小管上皮細胞變性、壞死，可見蛋白管型;間質(zhì)炎癥反應(yīng)，間質(zhì)細胞增生，間質(zhì)纖維化評分明顯增高，且隨劑量增加病變更為嚴重，與其他研究報道一致［7］。

細胞凋亡是細胞在基因控制下的生理性程序化死亡，主要是通過啟動內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的活性而發(fā)生的細胞自然死亡過程。機體通過凋亡清除損傷、衰老和突變的細胞，維持生理平衡。過度凋亡導致細胞構(gòu)成的損失，留下的空間被細胞外基質(zhì)替代，并影響機體對損傷區(qū)域內(nèi)的組織細胞修復能力，可促進間質(zhì)的纖維組織增生。本部分研究發(fā)現(xiàn)，CsA小劑量和大劑量模型組腎組織中凋亡細胞明顯增加，且與劑量相關(guān)，說明CsA可導致以腎小管間質(zhì)細胞為主的腎細胞凋亡，形成腎間質(zhì)纖維化，是導致CsA慢性腎毒性的發(fā)病機制之一。體外研究表明，CsA可以直接引起腎小管細胞LLC-PK1凋亡;在CsA慢性腎毒性動物模型中也發(fā)現(xiàn)，腎小管間質(zhì)損傷區(qū)域凋亡細胞明顯增多，且與給藥的劑量和時間呈正相關(guān)，均支持本研究結(jié)論。

p27是一種周期素依賴性激酶抑制蛋白，通過抑制CDK或細胞周期蛋白E/CDK復合物的活性來調(diào)控細胞周期的進程，限制細胞通過G1/S點，為細胞周期負性調(diào)控因子，更作為凋亡的始動因子誘導細胞凋亡。體外試驗中發(fā)現(xiàn)p27過度表達可誘導癌細胞凋亡。p27促進凋亡的作用可能與其導致的多聚核酶的裂解和CyclinB1的降解有關(guān)。應(yīng)用免疫組化方法發(fā)現(xiàn)早期胃癌組織中p27著色指數(shù)與凋亡指數(shù)顯著相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，CsA模型組p27陽性細胞百分比明顯增加，隨著給藥劑量增加p27陽性細胞百分比增加，且與細胞凋亡百分比呈正相關(guān)。體外研究表明，CsA可引起細胞周期發(fā)生改變:G0/G1期細胞增多，DNA合成減少，S及G2/M期細胞減少。因此，推測CsA上調(diào)了周期素依賴性激酶抑制蛋白p27表達，阻止細胞通過G1/S限制點，G0/G1期細胞增多，腎小管上皮細胞凋亡增加，參與CsA慢性腎毒性發(fā)生發(fā)展。

EGb是從銀杏葉中提取的復方組分，其主要有效成分為銀杏黃酮甙類(Ginkgoflavone glycosides)、銀杏內(nèi)酯(Ginkgolides)和白果內(nèi)酯等。EGb具有廣泛的藥理學作用:如清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化;保護線粒體氧化磷酸化;影響血管內(nèi)皮細胞因子和兒茶酚胺的釋放;拮抗血小板活化因子受體;抗炎以及調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂等。我們以往研究發(fā)現(xiàn)，EGb可能通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)而拮抗高糖和 AGEs誘導的 TGF-β1、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、纖維連接蛋白(Fn)的過表達［8］。EGb 以濃度依賴方式抑制TGF-β1誘導的HKC表型轉(zhuǎn)化，下調(diào)單核細胞趨化蛋白(MCP-1)表達［9］。根據(jù)EGb的藥理作用推測其可能對CsA慢性腎毒性有防治作用，但國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。本研究發(fā)現(xiàn)EGb治療組與CsA模型組相比尿蛋白水平明顯下降，組織學檢查腎間質(zhì)纖維化評分提示EGb治療組較CsA模型組有不同程度減輕，經(jīng)EGb治療后，腎小管間質(zhì)細胞周期素依賴性激酶抑制蛋白p27表達下降，細胞凋亡減少。表明EGb可減少細胞凋亡，減輕CsA導致的腎小管變性壞死，腎間質(zhì)纖維化，而發(fā)揮腎臟保護作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CsA使腎小管上皮發(fā)生細胞周期阻滯，誘發(fā)以腎小管間質(zhì)細胞為主的腎細胞凋亡可能是CsA慢性腎毒性發(fā)病機制之一。EGb可減少細胞凋亡，減輕CsA導致的腎小管變性壞死，腎間質(zhì)纖維化，從而減輕腎毒性。因此，認為EGb制劑有可能作為輔助藥物減少CsA的腎毒性，從而使CsA能更安全、長期應(yīng)用于臨床治療。

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