談世進，王艷妮，丁在咸

(1.上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院老年病科，上海 200233;2.上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院動物實驗中心，上海 200233)

流行病學研究顯示，老年男性隨著年齡的老化體內(nèi)雄激素水平也成逐漸下降的趨勢，而心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率卻逐步增加。以前的研究結(jié)果表明，老年男性冠心病患者靶器官損傷可能與雄激素水平低下密切相關(guān)［1］，但其作用機制尚不完全清楚。睪酮是雄激素中最具有活性的，它對于促進機體的生長發(fā)育、維持心血管功能等具有重要的生理作用。血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cell，VEC)通過合成和分泌多種血管活性物質(zhì)在動脈粥樣硬化(artherosclerosis，AS)的發(fā)生、發(fā)展中占有重要的地位和作用，一氧化氮(nitric oxide，NO)與內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)是內(nèi)皮細胞分泌的調(diào)節(jié)和平衡血管舒縮功能而參與AS的重要因子。觀察睪酮水平的變化對NO、ET-1的影響將有助于了解睪酮對VEC功能的影響，從而初步探討睪酮在AS過程中的作用。本研究以雄性去勢大鼠為實驗模型，采用 NO、ET-1等指標，觀察不同水平睪酮對VEC功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級雄性 Wistar-Kyoto(WKY)大鼠，3～4個月齡，體質(zhì)量250 g左右，共30只，由中科院動物實驗中心提供。

1.1.2 主要試劑和儀器 睪酮放免試劑盒(上海藍基生物有限公司)，Sn-695B型γ放射免疫計數(shù)器，自動平衡式離心機，光學顯微鏡，大鼠血清內(nèi)皮素ELISA試劑盒(B.G公司)，大鼠NO檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，731型分光光度計等。

1.2 動物模型和組織標本的制備

1.2.1 大鼠去勢模型的建立和分組 將30只雄性Wistar大鼠隨機分為3組:單純?nèi)萁M、假手術(shù)組和補充睪酮組，每組10只。全部適用性喂養(yǎng)2周后開始實驗。在腹腔注射氯胺酮10 mg/100 g麻醉后，需要去勢的大鼠碘酒、酒精依次消毒陰囊皮膚，縱膈正中切開一縱行切口，剪開鞘膜后，分別將雙側(cè)睪丸與附睪分離，并且切除睪丸，然后把附睪放回陰囊，青霉素沖洗腹腔后逐層縫合皮膚，術(shù)后腹腔注射青霉素2×104U/d，共3 d;假手術(shù)組只找出雙側(cè)睪丸與附睪分離但不切除，然后放回陰囊。

1.2.2 動物飼養(yǎng)與給藥 常規(guī)條件下分籠飼養(yǎng)，光線保持12 h晝夜循環(huán)，室溫控制在27℃左右，濕度維持在40% ～50%，自由進水、進食，標準顆粒飼料。補充睪酮組，大鼠去勢后2 d注射生理劑量睪酮2 mg/kg。

1.2.3 標本收集和處理 所有大鼠8周后取材。麻醉大鼠后，剖開胸腔，暴露心臟并取血，分別注入預先制備好的EDTA抗凝管及普通管，管口封閉好并顛倒混勻即放入4℃冰箱中1～2 h，取出后2 500 g 4℃離心7 min，分離出血漿或血清，取上清分裝，檢測血漿睪酮、一氧化氮(NO)及血清內(nèi)皮素-1(ET-1)水平。放射免疫法測定睪酮水平、ELISA法定量檢測血清ET-1水平、比色法測定NO水平，均嚴格按照試劑盒說明進行操作。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗結(jié)果以±s表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，組間均數(shù)比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠血漿睪酮濃度的變化

較假手術(shù)組血漿睪酮濃度，單純?nèi)萁M明顯降低(P＜0.05)，補充睪酮組無明顯變化(P＞0.05)，見表1。

表1 3組大鼠血漿睪酮水平Tab.1 Plasma testosterone levels in 3 groups of rats±s)

表1 3組大鼠血漿睪酮水平Tab.1 Plasma testosterone levels in 3 groups of rats±s)

* 較假手術(shù)組，P ＜0.05，＊＊較單純?nèi)萁M，P ＜0.05

組 別 n 睪酮濃度/(ng·ml－1)單純?nèi)萁M 10 0.28 ±0.07*假手術(shù)組 10 2.47 ±0.53補充睪酮組 10 3.05 ±0.56＊＊

2.2 3組大鼠血漿NO含量變化

從表2可以看出，單純?nèi)萁M血漿NO水平明顯低于假手術(shù)組，P＜0.05;補充睪酮組無明顯變化，(P＞0.05)。

表2 3組大鼠血漿NO含量Tab.2 Plasma NO levels in 3 groups of rats ±s)

表2 3組大鼠血漿NO含量Tab.2 Plasma NO levels in 3 groups of rats ±s)

* 較假手術(shù)組，P ＜0.05，＊＊較單純?nèi)萁M，P ＜0.05

組 別 n NO 含量/(μmol·ml－1)單純?nèi)萁M 10 21.61 ±10.51*假手術(shù)組 10 33.44 ±8.50補充睪酮組 10 36.06 ±9.25＊＊

2.3 3組大鼠血清ET-1含量的變化

與假手術(shù)組比較，單純?nèi)萁M大鼠血清ET-1含量明顯升高(P＜0.05);而補充睪酮組無明顯變化(P＞0.05)。

表3 3組大鼠血清ET-1含量Tab.3 Plasma ET-1 levels in 3 groups of rats(±s)

表3 3組大鼠血清ET-1含量Tab.3 Plasma ET-1 levels in 3 groups of rats(±s)

* 較假手術(shù)組，P ＜0.05，＊＊較單純?nèi)萁M，P ＜0.05

組 別 n ET-1含量/(ng·ml－1)單純?nèi)萁M 10 4.41 ±0.34*假手術(shù)組 10 3.84 ±0.16補充睪酮組 10 3.95 ±0.23＊＊

3 討 論

血管內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化的始動因素，同時參與AS的發(fā)生、發(fā)展，而損傷的血管內(nèi)皮細胞會發(fā)生形態(tài)和功能的改變，從而對血管的生理病理產(chǎn)生重要的影響，多種因素可引起血管內(nèi)皮功能的損傷與減退，如糖尿病、高脂血癥、高血壓等等［2-3］。隨著年齡的增長，人體內(nèi)雄激素水平呈進行性下降的趨勢，心血管疾病的發(fā)生率逐漸增加，提示體內(nèi)雄激素水平的變化與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展存在一定的聯(lián)系。一些臨床研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)［1-4］，在老年患者中，隨著體內(nèi)雄激素水平的減少，其內(nèi)皮功能與靶器官均出現(xiàn)損害，且表現(xiàn)出很強的相關(guān)性。目前雄激素對血管內(nèi)皮細胞功能的影響的機制仍未闡明。付海霞等［5］研究內(nèi)源性睪酮對球囊損傷的血管內(nèi)皮細胞功能和結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果電鏡下觀察到兩組血管內(nèi)膜均幾乎完全被新生內(nèi)皮覆蓋，再生血管內(nèi)皮細胞胞體肥大，輪廓模糊;光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)兩組血管內(nèi)膜面積和內(nèi)膜/中膜面積比值差異無顯著性，提示內(nèi)源性睪酮水平短時低于生理水平時對VEC再生、新生內(nèi)膜形成無明顯影響，但可能有改善損傷的VEC功能的傾向。而褚連軍等［6］發(fā)現(xiàn)在性機能減退患者中，其體內(nèi)的睪酮水平低下，同時伴有內(nèi)皮祖細胞水平的降低，且使用磷酸二酯酶抑制劑伐地那非后內(nèi)皮組細胞水平無改善;而補充睪酮達到生理量水平后，患者體內(nèi)的內(nèi)皮祖細胞水平恢復正常對照水平，且再次使用伐地那非后內(nèi)皮組細胞水平有著明顯改善，提示體內(nèi)正常的睪酮水平是維持內(nèi)皮祖細胞對磷酸二酯酶5抑制劑應(yīng)答的必需條件。但也有體外實驗研究結(jié)果顯示睪酮可呈劑量依賴性地抑制VEC合成DNA及促進VEC的凋亡［7］。

VEC在體內(nèi)起了極其重要的生理作用，其合成的具有強大的擴血管作用的血管活性物質(zhì)是NO，而NO代謝紊亂則成為AS等內(nèi)皮相關(guān)性疾病的重要因素。ET-1是VEC唯一產(chǎn)生的ET，具有強大而持久的縮血管作用。當VEC功能障礙時，合成和釋放的NO與ET-1發(fā)生變化，引起血管舒縮功能異常、白細胞粘附調(diào)節(jié)障礙、血小板異常聚集和血栓形成等，這些都與AS的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系［8-9］。目前雄激素水平對內(nèi)皮功能的影響結(jié)論不盡統(tǒng)一。有研究結(jié)果認為成年男性中內(nèi)源性雄激素水平下降可改善內(nèi)皮依賴性舒張功能［10］。國內(nèi)有研究探討不同濃度睪酮對脂多糖損害的體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對于脂多糖損傷的內(nèi)皮細胞低于生理劑量的睪酮也可以起促進NO的釋放，但是NO水平明顯低于正常對照組，當睪酮濃度越接近生理劑量時NO水平越接近對照組，提示睪酮對NO的作用效果與睪酮濃度相關(guān)［11］。也有研究發(fā)現(xiàn)生理濃度睪酮或接近生理濃度的睪酮對人臍靜脈內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化生長因子-β1和血紅素加氧酶-1的表達呈時間和濃度依賴關(guān)系［12］。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單純?nèi)萁M血漿NO含量明顯低于假手術(shù)組(P＜0.05)，而補充生理劑量睪酮后，其NO的水平有明顯的升高;與假手術(shù)組比較，單純?nèi)萁M大鼠血清ET-1含量明顯升高(P＜0.05)，而補充睪酮組的ET-1含量明顯下降，提示單純?nèi)莺笫勾笫篌w內(nèi)睪酮水平低于生理水平時對VEC存在一定程度的損傷，引起功能障礙，從而釋放到外周血中的血管活性物質(zhì)NO、ET-1發(fā)生變化。雄激素對心血管系統(tǒng)具有重要影響，在血管內(nèi)皮受損過程中，睪酮可以促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移、修復，改善內(nèi)皮功能。生理水平的雄激素可以抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展;可以改善脂質(zhì)的代謝［13］。

總之，在本實驗條件下提示雄激素缺乏可損傷血管內(nèi)皮細胞，伴NO生成減少與ET-1釋放增加，進一步促進AS的發(fā)生和發(fā)展。既往有研究結(jié)果表明雄激素水平降低與男性AS的發(fā)病率高密切相關(guān)［14］，但是AS的發(fā)生是多因素作用的結(jié)果，其中機制相當復雜，而雄激素在AS的進程中所起作用的機制尚未闡明，還需進一步研究來證實。

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