彭 清，溫雪萍，顏志軍，高習文

(上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 201199)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸系統(tǒng)常見的疾病，在吸煙等環(huán)境因素的作用下，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷增加。和支氣管哮喘一樣，COPD也是一個氣道炎癥性疾病，中性粒細胞的募集和活化是COPD發(fā)病中的一個關鍵環(huán)節(jié)。TH17細胞是新發(fā)現(xiàn)的除TH1細胞和TH2細胞之外的 CD4+T細胞［1-2］，其分泌的IL-17具有強大的招募中性粒細胞的功能［3-6］。THl7細胞在COPD的發(fā)病中扮演重要角色［7］。因此，進一步探討TH17細胞在COPD中的具體作用及其機制顯得尤為迫切。近年來，糖皮質(zhì)激素在COPD尤其是重度、極重度COPD中的應用越來越受到重視。糖皮質(zhì)激素能降低IL-17、IL-6和TNF-α等細胞因子的表達［8-9］，那么糖皮質(zhì)激素是否也通過對TH17的調(diào)節(jié)達到抑制COPD慢性炎癥過程，目前尚無報道。本課題通過比較健康人群、COPD穩(wěn)定期患者TH17細胞構成和細胞因子分泌情況，探討TH17細胞在COPD中的作用;通過應用糖皮質(zhì)激素對COPD患者進行干預，探討糖皮質(zhì)激素是否通過對TH17的調(diào)節(jié)達到抑制COPD慢性炎癥過程。本研究有助于明確COPD的發(fā)病機制，對于今后COPD患者的治療提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑

PE-CY5抗人CD4單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)購自BD pharmingen公司。PE抗人IL-17mAb及同型對照均購自ebioscience公司。佛波酯(Phorbol 12-myristate-13-acetate，PMA)、離子霉素(Ionomycin)、莫能菌素(Monensin)、植物血凝素P(Phytohenmagglutinin-P，PHA)及皂素購自美國Sigma公司。人淋巴細胞分離液購自上海博蘊生物科技有限公司。RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自Gibco公司。人細胞因子IL-17、IL-4及IFN-γ的酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒購自R＆D公司。

1.2 研究對象

根據(jù)慢性阻塞性肺疾病診治指南的診斷標準，吸入支氣管舒張劑后第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)/用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)＜70%，F(xiàn)EV1占預計值＜50%，選取1個月內(nèi)未應用全身激素的COPD穩(wěn)定期患者共38例，所有患者給予規(guī)律吸入布地奈德800 μg/d，研究持續(xù)3個月，3個月后為治療組。研究期間若出現(xiàn)癥狀，可按需使用短效支氣管擴張劑，其中8例出現(xiàn)COPD急性加重，予以剔除，剩余30例為COPD穩(wěn)定期組，其中男性22例，女性8例，平均年齡(58.53±6.94)歲。我院門診不吸煙的健康體檢者30例為正常對照組，其中男性20例，女性10 例，平均年齡(55.30 ±6.99)歲，兩周內(nèi)無急性感染，無長期用藥史，肺功能正常。本實驗通過倫理委員會批準，入選患者均簽署知情同意書。

1.3 流式細胞術檢測外周血TH17細胞的表達

抽取入選研究對象的外周靜脈血3 ml(肝素抗凝)，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，調(diào)整PBMC密度至2×106ml。懸浮于RPMIl640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和0.1 ng/ml鏈霉素)。取PBMC懸液(2×106ml－1)加入24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1 ml，加入PMA(20 ng/ml)、離子霉素(1 μg/ml)和莫能菌素(2 nmol/ml)，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h(37℃，5%CO2)。收集細胞后分為同型對照管和實驗管，加入PE-CY5抗人CD4 mAb 10 μl避光室溫孵育30 min。洗滌棄上清，予4%多聚甲醛固定，室溫放置 20 min。予 0.1%皂素穿膜10 min，離心棄上清，每管約留200 μl穿膜液重懸細胞。實驗管加入PE抗人 IL-17 mAb 10 μl，同型對照管加入同型對照抗體，室溫避光孵育1 h。洗滌后重懸細胞于300 μl洗滌液，上流式細胞儀檢測。以CD4直方圖設門區(qū)分出CD4+細胞，以散點圖表示IL-17+細胞，用CellQuest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)。

1.4 ELISA 檢測 IL-17、IL-4、IFN-γ 水平

抽取入選研究對象的外周靜脈血5 ml(肝素抗凝)。全血離心后收集血漿－80℃凍存待ELISA檢測。取上述凍存的血漿，通過ELISA雙抗體夾心法檢測細胞因子 IL-17、IL-4、IFN-γ，具體操作按照試劑盒提供的說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)資料均以±s表示。所有數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件包進行分析，統(tǒng)計分析采用方差分析及q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 外周血TH17細胞比例

通過流式細胞術對細胞表面標志及細胞因子的檢測顯示，外周血中CD4+IL-17+細胞(TH17細胞)比例在三組之間有顯著差異(P＜0.05)，COPD穩(wěn)定期組TH17細胞在外周血CD4+陽性細胞中所占的比例(3.13±0.91)%，要高于治療組(2.30±1.95)%和正常對照組(1.21 ±0.40)%，治療組外周血中TH17細胞比例也顯著高于正常對照組(P＜0.01)。

2.2 血漿中 IL-17、IL-4、IFN-γ 水平

ELISA檢測表明，血漿中 IL-17和 IFN-γ水平在三組之間有顯著差異(P＜0.01)，其中COPD穩(wěn)定期組要高于治療組和正常對照組，而治療組也均高于正常對照組。血漿中IL-4水平在三組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

表 1 血漿 IL-17、IL-4、IFN-γ水平Tab.1 Comparison of levels of plasma IL-17，IL-4 and IFN-γ in three groups(pg/ml)

3 討 論

COPD是世界范圍內(nèi)危害人類健康的疾病，發(fā)病率和死亡率都很高，其確切發(fā)病機制仍不十分清楚，反復發(fā)生的氣道慢性炎癥在COPD的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用，中性粒細胞、CD8+T淋巴細胞、巨噬細胞是COPD異常炎癥反應的三種關鍵細胞，有多種細胞因子、趨化介質(zhì)、蛋白酶和氧化應激等參與COPD炎癥的發(fā)生。中性粒細胞的募集和活化是COPD發(fā)病中的一個關鍵環(huán)節(jié)。研究提示:COPD患者支氣管肺泡灌洗液及誘導痰中中性粒細胞明顯增加，甚至在已戒煙患者發(fā)現(xiàn)了同樣的炎癥過程，表明炎癥發(fā)生后即在氣道內(nèi)持續(xù)存在，且肺功能測量值第1秒用力呼氣容積(FEV1)與氣道中性粒細胞的數(shù)量呈負相關［10］。COPD患者嚴重程度越重往往中性粒細胞數(shù)量越高，氣道炎癥越顯著。中性粒細胞在呼吸道大量滲出是COPD炎癥反應的特征，但中性粒細胞活化和聚集的機制尚未完全清楚，目前認為與巨噬細胞、T淋巴細胞及上皮細胞等所釋放炎性趨化因子的作用和粘附機制相關。

TH17細胞是新發(fā)現(xiàn)的除TH1細胞和TH2細胞之外的CD4+T細胞，分泌IL-17、IL-6和TNF-α，從而發(fā)揮其生物學效應［11］。THl7細胞分泌的IL-17能在組織局部誘導產(chǎn)生多種細胞因子、生長因子和趨化因子，促進中性粒細胞向病灶部位遷移［3-4，12］。IL-17敲除小鼠不能招募中性粒細胞至感染部位，從而使遲發(fā)型超敏反應、接觸性過敏反應下降。中性粒細胞是COPD異常炎癥反應的關鍵細胞，THl7細胞分泌的IL-17具有強大的招募中性粒細胞的功能，那么THl7細胞在COPD的發(fā)病中是否扮演重要角色，認為細菌、病毒、一些非典型病原體及大氣污染等均可導致COPD急性加重，而這些因素可能影響了TH17細胞的表達，因此本課題僅選取COPD穩(wěn)定期患者作為研究對象。通過流式細胞術對細胞表面標志及細胞因子的檢測顯示，COPD穩(wěn)定期組外周血中TH17細胞表達要顯著高于正常對照組，同樣ELISA檢測表明，COPD穩(wěn)定期組血漿中IL-17的表達水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義。因此，結(jié)合目前國內(nèi)外的研究我們認為，TH17細胞可能通過其釋放的IL-17誘導成纖維細胞釋放IL-6、IL-8、前列腺素E、粒細胞集落刺激因子等，刺激巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β、TNF-α，促進中性粒細胞趨化與激活，從而參與COPD的氣道炎癥［13-15］。近年來，有學者提出了COPD是自身免疫性疾病的假設［16-20］。已有一些證據(jù)顯示，TH17細胞是自身免疫性疾病的重要致病因素［21］，其分泌的IL-17可能通過誘導和維持炎癥，參與適應性免疫在COPD 的發(fā)生、發(fā)展中起作用［22］。

以往的研究認為激素在哮喘中有效，是因為可以抑制哮喘氣道中的嗜酸性粒細胞炎癥，COPD穩(wěn)定期沒有嗜酸性粒細胞，主要為嗜中性粒細胞，而中性粒細胞炎癥對激素抵抗，故不主張將激素應用于COPD［23-24］。糖皮質(zhì)激素在COPD尤其是重度、極重度COPD中的應用越來越受到重視。Gartlehner等［25］對ICS治療COPD的臨床研究資料做了薈萃分析，結(jié)果表明與安慰劑相比，長期應用ICS雖然不影響COPD的死亡率，但可顯著減少急性加重的次數(shù)。2008年GOLD推薦ICS適用于有呼吸道癥狀，第1秒用力呼氣容積占預計值的百分比(FEV1%)＜50%，而且有反復急性加重的COPD患者。那么糖皮質(zhì)激素究竟通過什么途徑發(fā)揮其生物學效應。TH17的發(fā)現(xiàn)可能為此提供了啟示。Prause等［8］研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素能顯著降低內(nèi)毒素誘導的小鼠肺組織、支氣管灌洗液中IL-17的表達，從而抑制了中性粒細胞的聚集，發(fā)揮其抗炎作用。還有研究報道在H5N1病毒誘發(fā)小鼠ARDS的模型中，糖皮質(zhì)激素能夠顯著降低支氣管灌洗液中IL-6和TNF-α的表達［9］。本研究表明COPD穩(wěn)定期組TH17細胞和血漿中IL-17的表達要顯著高于正常對照組，給予吸入糖皮質(zhì)激素治療后，TH17細胞和血漿中IL-17的表達較前明顯降低，仍高于正常對照組。糖皮質(zhì)激素可能通過對TH17細胞的抑制，降低了其分泌的細胞因子水平，減少了其炎性效應，從而緩解了臨床癥狀，改善生活質(zhì)量。

綜上所述，TH17細胞可能通過其釋放的IL-17，促進中性粒細胞趨化與激活，從而在COPD的發(fā)生、發(fā)展各個環(huán)節(jié)中起著重要作用，而糖皮質(zhì)激素可能通過對TH17的調(diào)節(jié)達到抑制COPD慢性炎癥過程。TH17細胞表達水平的增加是否可作為一種判斷COPD及其預后的獨立指標，以及以TH17細胞中心的靶像治療在COPD中的可行性與有效性尚需大樣本多因素的臨床實驗研究來支持。進一步研究TH17細胞在COPD中的作用和各種具體機制，尤其是基因調(diào)控機制，不僅對更深入了解COPD的發(fā)病機制，而且對COPD患者的預后評估以及臨床治療都有著非常重要的意義。

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