鄭莉莉，李 佳，房 林

(同濟大學附屬第十人民醫(yī)院甲乳外科，上海 200072)

原發(fā)性肝癌在世界范圍內(nèi)是第五位最常見和第三位致死率最高的惡性腫瘤。我國是原發(fā)性肝癌的高發(fā)區(qū)，占全球肝癌病例的55%。因此，對原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展分子機制進行探討、研究具有十分重要的意義。近10年來，大量研究表明microRNAs參與了腫瘤的形成和演進［1-4］。在肝癌中，研究者發(fā)現(xiàn)肝癌組織中microRNAs表達與配對正常組織明顯差異。目前尚不知miR-200a在肝癌中表達情況及其功能，因此本研究運用熒光定量PCR檢測miR-200a在肝癌細胞HepG2和正常肝細胞QSG-7701中表達水平，后行功能試驗探索其對于HepG2細胞增殖、周期、凋亡和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

人肝癌細胞HepG2和正常肝QSG-7701細胞株購于中國科學院。

1.2 miRNAs提取和逆轉(zhuǎn)錄

按照TIANGEN公司miRcute microRNA提取分離試劑盒說明書進行操作。microRNAs逆轉(zhuǎn)錄參照Chen等［10］的方法，通過特異莖環(huán)引物，按照下列順序在PCR試管中加入反應物(體積為8.6 μl):超純水 2 μl，5 × buffer 1.7 μl，microRNAs 莖環(huán)引物(各個 microRNAs 及內(nèi)參 U6)1.9 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶(Primescript RT Enzyme MixI)1 μl，microRNAs sample 2 μl。反應條件為:16、42、85、4 ℃ 10 min，反應結(jié)束后置于4℃冰箱保存。

1.3 實時定量RT-PCR

按照Takara公司SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)DRR041A說明書完成加樣，反應條件為95℃預變性2 min;變性95℃ 30 s，退火、延伸60℃45 s，重復35個循環(huán)，70℃ ～95℃繪制融解曲線。反應結(jié)束后，RQ manager分析軟件統(tǒng)計處理，獲取Ct值，并根據(jù)熔解曲線判斷產(chǎn)物的純度。

1.4 細胞增殖檢測

HepG2細胞計數(shù)后，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基以按25×104個細胞/孔接種于6孔板上。待六孔板細胞密度長到約80% ～90%時，按照TIANGEN公司脂質(zhì)體說明書，以1 μg miR-200a mimics:3 μl脂質(zhì)體比例完成miR-200a轉(zhuǎn)染，并使miR-200a終濃度分別達到 50、100、150 nmol/L，空對照組為脂質(zhì)體處理組，負對照組為小分子RNA片段轉(zhuǎn)染組，均不加miR-200a mimics。5～6 h后，細胞消化重懸計數(shù)，以1 000細胞/孔分別接種入96孔板。按24、48、72 h三個細胞培養(yǎng)時間段進行如下操作;每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸取上清棄掉，每孔加入150 μl DMSO(二甲基亞砜)，置搖床上低速震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀測量490 nm處各孔的吸光值。

1.5 細胞周期與凋亡檢測

miR-200a mimics轉(zhuǎn)染同 MTT試驗，使 miR-200a終濃度達到100 nmol/L。轉(zhuǎn)染24 h后細胞消化重懸離心，4℃，3 200 r/min，10 min;PBS洗滌2次;加入預冷70%乙醇，4℃固定過夜;RNase(終濃度為0.1 g/L)消化30 min;細胞染色:加入0.05 g/L 碘化丙錠(PI)250 μl，室溫避光染色 30 min，流式細胞儀檢測。按照以下公式計算細胞增殖指數(shù)(PI)，以衡量細胞的分裂活動:PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)。細胞凋亡實驗，配置標記液:Buffer以ddH2O四倍稀釋;Annexin V液:50 μl Buffer+2.5 μl Annexin V;PI 液:250 μl Buffer+5 μl PI;標記:每 105細胞加入 52.5 μl Annexin V液，混勻，避光反應15～20 min;加入255 μl PI液，避光反應3～5 min;混勻上機檢測，統(tǒng)計結(jié)果。

1.6 Transwell實驗

①1%BSA配制;②細胞六孔板鋪板及miR-200a mimics轉(zhuǎn)染同MTT試驗;③包被基底膜:用50 mg/L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風干;水化基底膜:吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50 μl含10 g/L BSA的無血清培養(yǎng)液，37℃，30 min;④轉(zhuǎn)染后48 h，在24孔板中，每孔加入500 μl含有10%FBS的DMEM 培養(yǎng)基;將轉(zhuǎn)染后細胞消化，PBS清洗后用含有0.1%BSA的不含血清的DMEM培養(yǎng)基重懸。重懸細胞計數(shù)后，按照8×104個細胞/小室接種于transwell上室中，最終保持上室內(nèi)100 μl培養(yǎng)基。在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h;⑤Transwell小室染色:取出小室，吸取小室中培養(yǎng)液，然后用棉簽將上室內(nèi)部擦干凈;將小室膜的下表面用PBS浸泡清洗，然后用95%乙醇固定10 min，然后風干;用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，自來水沖洗3次;風干后拍照;拍照后用300 μl 33%冰醋酸溶解膜上的結(jié)晶紫，酶標儀測定573 nm處吸光值。

1.7 統(tǒng)計學方法

實時熒光定量檢測，結(jié)果分析根據(jù)Kenneth［11］的描述，采用半定量分析。本實驗用兩獨立樣本t檢驗檢測miR-200a在肝癌細胞HepG2和正常肝QSG-7701細胞中的表達水平，P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。細胞功能試驗所有標本均重復檢測三次，去除異常值后取平均值行t檢驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析HepG2細胞株轉(zhuǎn)染組及對照組之間的差異。

2 結(jié) 果

2.1 Real-time PCR 結(jié)果

Real-time PCR結(jié)果顯示肝癌細胞HepG2中miR-200a相對表達水平為正常肝細胞的4.79倍，miR-200a的表達水平在癌細胞相較于正常細胞明顯高表達(P＜0.01)。

2.2 MTT試驗結(jié)果分析

分別以50、100和150 nmol/L濃度的miR-200a mimics作用于肝癌細胞株HepG2 24、48和72 h后，測定各組490 nm處吸光值，并計算促進率。促進率計算公式如下:促進率(%)=(對照組吸光值－實驗組吸光值)/對照組吸光值×100%。與對照組比較，miR-200a促進作用一定程度上呈劑量及時間依賴性。當作用時間為72 h、濃度為150 nmol/L時，對該株細胞的增殖促進最強，促進率為38.4%(表1)。

表1 miR-200a mimics轉(zhuǎn)染肝癌細胞株后對細胞增殖的影響Tab.1 The effect of miR-200a on the proliferation of liver cancer HepG2 cells

2.3 細胞周期、凋亡檢測

用100 nmol/L miR-200a mimics轉(zhuǎn)染HepG2細胞株24 h后，流式細胞儀分析顯示G0/G1期細胞數(shù)量無顯著增多，G2/M期細胞數(shù)量無明顯變化，S期細胞數(shù)量未見明顯減少，細胞增殖指數(shù)無明顯降低(表2)。Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞計數(shù)定量分析結(jié)果顯示，miR-200a在肝癌細胞株中的表達升高不能明顯誘導其發(fā)生早期凋亡(0.5±0.06)%，與空對照組(0.3 ±0.04)%，負對照組(0.48±0.02)% 比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)n=3(圖1)。

表2 miR-200a mimics轉(zhuǎn)染肝癌細胞株后對細胞周期的影響Tab.2 The effect of miR-200a on the cell cycle changes of liver cancer HepG2 cells

2.4 Transwell試驗

酶標儀測定573 nm處吸光值顯示100 nmol/L miR-200a mimics實驗組相對穿出小室膜腫瘤細胞數(shù)為 0.348 ±0.005 657，與空對照組 0.296 ±0.006 364，負對照組0.287 ±0.005 364 差異有顯著性(P＜0.05)，表明miR-200a能夠明顯促進腫瘤細胞侵襲。

3 討 論

microRNAs作為非編碼性小分子 RNA通過mRNA降解和翻譯抑制參與了肝癌細胞的增殖［5］、凋亡［6］、侵襲轉(zhuǎn)移［7］，腫瘤干細胞的惡性轉(zhuǎn)化［8］。越來越多的研究表明血液中microRNAs表達譜可以作為早期診斷肝癌的指標［9-10］。本次研究發(fā)現(xiàn)miR-200a在肝癌細胞HepG2中表達明顯高于正常肝細胞，Li等發(fā)現(xiàn)miR-200a在胰腺癌組織及其血液標本中高表達［11］，而在乳腺癌標本中，miR-200a表達水平卻明顯下調(diào)［12］，這些發(fā)現(xiàn)提示 miR-200a在腫瘤組織中的表達具有組織特異性，未來可用于協(xié)助早期診斷肝癌。

MiR-200a在肝癌細胞HepG2中的表達水平明顯上調(diào)，相比較負對照組和空對照組，上調(diào)miR-200a表達能夠明顯促進肝癌細胞增殖和侵襲。Li，YX等使用反義核苷酸鏈下調(diào)miR-200a表達，發(fā)現(xiàn)臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖和侵襲能力明顯下降［13］，而Xia等研究發(fā)現(xiàn) miR-200a通過作用于 ZEB2和CTNNB1抑制鼻咽癌細胞C666-1和CNE-1的增殖和侵襲［14］，提示miR-200a在不同的腫瘤類型中功能不同，其在肝癌中扮演著原癌基因的角色。

傳統(tǒng)的惡性腫瘤的治療策略，包括外科手術(shù)、放療和化療三種手段。近年來，又出現(xiàn)了肝癌特異性抗原的腫瘤免疫治療，劉揚等的研究發(fā)現(xiàn)AFP特異性的CD4+T和CD8+細胞在體外對人肝癌HepG2細胞有顯著殺傷活性，有望成為肝癌免疫治療新方法［15］。楊麗娟等［16］研究抗腫瘤抗生素光輝霉素MIT，MIT對肝癌Huh-7細胞有明顯的誘導凋亡和生長抑制作用，為探索肝癌治療的新方法提供可靠的理論依據(jù)。MicroRNAs介導的腫瘤分子治療將是根治腫瘤的重要發(fā)展方向。未來可將抗miR-200a的寡核苷酸轉(zhuǎn)染入腫瘤細胞，寡核苷酸包含可與致癌性microRNA互補結(jié)合的序列，競爭性抑制后者功能，從而達到消除腫瘤細胞的目的。也可將miR-200a海綿轉(zhuǎn)染入腫瘤細胞，“吸附”大量oncomicroRNA，從而避免其對天然 RNA的抑制。OncomiR-9在乳腺癌表達上調(diào)，參與腫瘤轉(zhuǎn)移，miR-9海綿有效終止了腫瘤細胞的侵襲［17］，為克服腫瘤提供了新的方向。

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