黃金海，孫躍輝，陳 瑞，莊世文，劉 瑩，王靜思

(1. 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

沙門氏菌是腸桿菌科中一大類重要的食源性致病菌，沙門氏菌引起的中毒病例位居世界各地食物中毒的首位．WHO食源性疾病監(jiān)控計劃顯示，歐洲每年約有160,000人感染沙門氏菌，大約每 100,000人中有 35人感染[1]，每年用于沙門氏菌的防控和治療費(fèi)用高達(dá)28億歐元[2]．在我國，70%～80%細(xì)菌性食物中毒事件是由沙門氏菌引起，引起沙門氏菌中毒的食品中，約90%是肉、蛋、奶等畜產(chǎn)品[3]．沙門氏菌感染畜禽后可引發(fā)一系列疾病，在動物屠宰過程中，腸道中的致病菌會污染屠宰環(huán)境或被帶到內(nèi)臟與體表，成為畜禽肉胴體、畜禽產(chǎn)品污染的重要來源[4-5]．衛(wèi)生檢測要求中，世界各國普遍規(guī)定食品中不得檢出沙門氏菌．

沙門氏菌傳統(tǒng)的檢測方法大多采用細(xì)菌分離、生化鑒定表型方法、基于抗體的免疫學(xué)方法等，在快速、敏感與特異性等方面有局限性[6]．PCR法需要昂貴的循環(huán)儀，不適于基層快速檢測．環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediate isothermal amplification，LAMP)是一種新穎的核酸擴(kuò)增技術(shù)，它依賴于識別靶 DNA上6個特定區(qū)域的4條引物和具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下高效擴(kuò)增核酸，反應(yīng)結(jié)果可通過肉眼觀察，具有高特異性、快速靈敏、操作簡單等特點(diǎn)．自 2000年該技術(shù)開發(fā)以來，LAMP技術(shù)在臨床疾病的診斷、流行性細(xì)菌以及病毒的檢測等方面應(yīng)用廣泛[7-9]．筆者針對沙門氏菌侵襲性因子 A基因(invA)設(shè)計一套 LAMP引物，對 7種血清型的沙門氏菌進(jìn)行檢測，優(yōu)化反應(yīng)條件，驗證其特異性和靈敏度，并應(yīng)用于食品的檢測，建立了沙門氏菌檢測方法．

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株名稱及編號見表 1，本實驗室分離、鑒定和保存．

表1 實驗用菌株Tab.1 Bacterial strains used in the experiment

1.2 主要試劑和儀器

細(xì)菌基因組 DNA抽提試劑盒(天根生化科技有限公司)，DNA-LAMP擴(kuò)增試劑盒(榮巖化學(xué)株式會社，日本)，LA-320CE實時濁度儀(榮巖化學(xué)株式會社，日本)．

1.3 方法

1.3.1 DNA模板的制備

(1) 試劑盒法：按照試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA．

(2) 煮沸法：細(xì)菌純培養(yǎng)物 1,mL于12,000,r/min離心 5,min，加入 100,μL 無菌水，混勻后，煮沸10,min，冰浴 2,min，12,000,r/min離心 5,min，上清液備用．

1.3.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank公布的沙門氏菌 invA基因(登錄號：EU348365)中保守序列，設(shè)計一套特異性的LAMP引物，包括外引物 F3、B3，2條內(nèi)引物 FIP、BIP和2條環(huán)引物L(fēng)F、BF．引物由Invitrogen公司合成，引物序列見表2．

1.3.3 LAMP反應(yīng)和結(jié)果判定

圖1 LAMP引物設(shè)計示意Fig.1 Schematic representation of LAMP primer design

表2 擴(kuò)增invA基因的LAMP引物序列Tab.2 DNA oligonucleotide primer Sequence of LAMP for the invA gene

反應(yīng)體系包括反應(yīng)緩沖液 12.5,μL，Bst DNA 聚合酶 1.0,μL，DNA 模板 2.0,μL，外引物 F3、B3 各5,pmol，內(nèi)引物 FIP、BIP 各 40,pmol，環(huán)引物 LF、BF各20,pmol，最后加入去離子水至總體積為25,μL．混勻后，置于 LA-320CE濁度儀，于 63,℃溫浴60,min，80,℃滅活 2,min．

反應(yīng)過程中，LA-320CE濁度儀對反應(yīng)體系的濁度進(jìn)行實時測量，每 6,s檢測一次體系在 650,nm處的吸光度，生成濁度變化曲線，當(dāng)反應(yīng)體系濁度超過0.25以及濁度的變化速率大于0.1時，結(jié)果判定為陽性．也可通過肉眼觀察反應(yīng)體系的濁度變化判定結(jié)果．

1.3.4 特異性實驗

用建立的 LAMP方法，分別對 7種不同血清型的沙門氏實驗菌株進(jìn)行檢測，同時以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬鏈球菌和空腸彎曲菌作對照，驗證方法的特異性．

1.3.5 靈敏度試驗

基因組 DNA檢測靈敏度：用試劑盒提取鼠傷寒沙門氏菌(JS1)基因組 DNA并測定其濃度，10倍倍比稀釋，DNA 原液至 10-1～10-7(體積分?jǐn)?shù)，下同)，各取2,μL 作為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)．

細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測靈敏度：將培養(yǎng)過夜的鼠傷寒沙門氏菌(JS1)菌液 10倍倍比稀釋至 10-1～10-6，取各稀釋度菌液 100,μL 進(jìn)行平板菌落計數(shù)，每組設(shè) 3個重復(fù)．同時，取各稀釋菌液 1,mL，用煮沸法提取DNA，取 2,μL上清液作為模板進(jìn)行 LAMP擴(kuò)增，利用LA-320CE對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行實時檢測．

1.3.6 食品樣品檢測

取細(xì)菌培養(yǎng)、常規(guī) PCR沙門氏菌檢測陰性的豬肉 10,g，無菌操作置于勻漿機(jī)并加入 90,mL 緩沖蛋白胨水(BP)，制備 1∶10稀釋的均質(zhì)液備用．取10,mL豬肉勻漿液，接入已知濃度的鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(JS1)，混勻后作為食品樣品原樣，之后以勻漿液為稀釋液10倍倍比稀釋，37,℃培養(yǎng)12,h后，各取1,mL用煮沸法提取DNA，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增．

2 結(jié) 果

2.1 沙門氏菌LAMP檢測方法的建立

以設(shè)計的一套特異性引物對沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(JS1)基因組 DNA進(jìn)行 LAMP擴(kuò)增，檢測結(jié)果見圖2．由圖 2(a)可知，以沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(JS1)基因組DNA 為模板的擴(kuò)增通道，吸光度大于 0.5，判斷為陽性，而以水為陰性對照的通道未出現(xiàn)擴(kuò)增；由圖2,(b)判定曲線可知，當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行到 16,min左右時，通道1濁度的變化速率為0.104，判為陽性．結(jié)果表明該引物能夠有效地擴(kuò)增沙門氏菌 invA基因，檢測時間約為16,min．

圖2 沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株LAMP檢測結(jié)果Fig.2 LAMP results of Salmonella standard strain

2.2 特異性實驗

特異性實驗結(jié)果如圖3所示，僅7株沙門氏菌出現(xiàn)LAMP擴(kuò)增，檢測結(jié)果為陽性，其他4種菌均無擴(kuò)增值，檢測結(jié)果為陰性，表明該引物特異性強(qiáng)．

圖3 沙門氏菌LAMP特異性實驗結(jié)果Fig.3 Specificity of Salmonella LAMP assay

2.3 靈敏度實驗

2.3.1 基因組DNA檢測靈敏度

沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(JS1)基因組 DNA濃度為45,ng/μL．10倍倍比稀釋DNA原液進(jìn)行LAMP檢測，結(jié)果顯示基因組DNA檢測限約為900,fg，見圖4．

圖4 沙門氏菌基因DNA LAMP檢測靈敏度Fig.4 Sensitivity of Salmonella genomic DNA LAMP assay

2.3.2 細(xì)菌培養(yǎng)物檢測靈敏度

經(jīng)平板計數(shù)，原始菌液濃度為 3.36×106,mL-1.10倍倍比稀釋菌液進(jìn)行 LAMP檢測，結(jié)果該法細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測限約為3.36×106,mL-1，見圖5．

2.3.3 食品樣品中沙門氏菌的檢測

采用無菌的豬肉勻漿構(gòu)建食品樣品模型，加入已知濃度的沙門氏菌培養(yǎng)液，構(gòu)建人工感染的食品原樣模型，使得食品原樣模型中沙門氏菌濃度為 8.25×103,mL-1，亦即模擬食品原樣中沙門氏菌的濃度為8.25×104,g-1．通道 1為豬肉勻漿中加入已知濃度沙門氏菌培養(yǎng)液作為食品原樣，通道2～通道5分別為食品原樣的 10倍梯度稀釋，作為食品樣品，提取DNA進(jìn)行 LAMP檢測，通道 8為無菌的豬肉勻漿．結(jié)果見圖 6，通道 1～4均出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增，通道5和通道8無擴(kuò)增，結(jié)果表明該法直接檢測食品樣品的檢測限為8.25,g-1．

圖5 沙門氏菌細(xì)菌培養(yǎng)物L(fēng)AMP檢測靈敏度Fig.5 Sensitivity of Salmonella LAMP assay

圖6 模擬食品樣品中沙門氏菌LAMP檢測靈敏度Fig.6 Sensitivity of Salmonella LAMP assay in artificially contaminated food

3 討 論

沙門氏菌是一種人畜共患的病原菌，能引起人和動物多重共患病，而食源性沙門氏菌污染檢測主要還是傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，費(fèi)時費(fèi)力，不利于在沙門氏菌暴發(fā)流行時準(zhǔn)確、快速地確定傳染源和傳染途徑，控制其流行．PCR方法敏感、準(zhǔn)確、快速，目前已廣泛用于食品中以及臨床樣品和環(huán)境中的沙門氏菌的檢測，但由于需要昂貴的儀器設(shè)備、較高檢測費(fèi)用以及對檢測人員較高的技術(shù)要求而使其不適用于現(xiàn)場快速檢測及基層應(yīng)用．LAMP依賴于能識別靶DNA上6個特定區(qū)域的4條引物和具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下高效擴(kuò)增核酸，保證了擴(kuò)增的高特異性和高效性，在反應(yīng)過程中核酸大量合成，從dNTPs析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)體系中的鎂離子結(jié)合，產(chǎn)生擴(kuò)增反應(yīng)副產(chǎn)物-焦磷酸鎂白色沉淀，反應(yīng)體系濁度發(fā)生變化，肉眼可見[10]，不需要昂貴的儀器，只需要一個恒溫的水浴即可實現(xiàn)檢測，操作簡單，便于現(xiàn)場快速檢測和基層應(yīng)用．也可以通過 LA-320CE實時濁度儀進(jìn)行實時反應(yīng)及終產(chǎn)物的一步檢測．

引物設(shè)計對于建立 LAMP方法非常重要，是檢測沙門氏菌成功與否的關(guān)鍵．用來設(shè)計引物的基因主要分 3類，即屬特異性引物基因、血清群特異性引物基因與血清型特異性引物基因．沙門氏菌的inv基因族具有屬特異性，inv基因族包括 invA、invB、invC、invD和invE等一組系列基因，它們在沙門氏菌中廣泛分布，而 invA基因編碼的蛋白在細(xì)菌的致病過程中起著重要的作用[6,11]．對沙門氏菌 invA 基因序列分析表明，沙門氏菌屬的不同沙門氏菌菌株的invA基因核苷酸序列存在較高的同源性，BLAST檢索與其他生物無同源關(guān)系，因此，invA基因是沙門氏菌的主要特征區(qū)域，常作為基因檢測和鑒定的依據(jù)[12]．本研究選擇與食品安全和公共衛(wèi)生密切相關(guān)的腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌等為研究對象，選擇 invA基因設(shè)計引物，對 7種不同血清型的沙門氏菌都能有效擴(kuò)增，而非沙門氏菌不擴(kuò)增，說明設(shè)計的引物對具有沙門氏菌屬特異性，可用于沙門氏菌的檢測．

與沙門氏菌培養(yǎng)物相比，食品中沙門氏菌的檢測具有更大的難度．直接用 LAMP檢測食品中的沙門氏菌面臨的一個問題是不能將活菌和死菌區(qū)別開來．由于檢測的靈敏性高，即使是樣品中存在死亡沙門氏菌的 DNA也會產(chǎn)生陽性結(jié)果，但死亡沙門氏菌的存在對食品安全并不構(gòu)成威脅，所以建立能夠區(qū)分死菌和活菌的方法對沙門氏菌檢測較為重要．為此，在LAMP檢測之前，需要選擇性增菌，以減少來自樣品中死亡沙門氏菌的 DNA的影響，從而增加了檢測方法對樣品生物安全評估的可信度，同時也提高了食品中沙門氏菌的檢出率．應(yīng)用建立的LAMP方法，液體樣品中沙門氏菌檢出下限為 336,mL-1，而常規(guī)PCR 的檢出線一般在 103～105,mL-1活菌水平[13]．應(yīng)用建立的LAMP方法，經(jīng)增菌培養(yǎng)程序后，可檢出含菌量為8.25,g-1的陽性肉品．

應(yīng)用LAMP方法對沙門氏菌進(jìn)行檢測，從檢測結(jié)果來看，方法特異、敏感，可有效檢測樣品中的沙門氏菌；檢驗周期短，每一批樣品從樣品準(zhǔn)備到檢出只需要2,h，如果將增菌時間計算在內(nèi)，也僅需要15,h；操作簡單，檢測成本低，不需要昂貴的檢測設(shè)備，檢測結(jié)果肉眼可見，可適應(yīng)國境口岸方便快捷的需要，在基層檢測中易于推廣，具有較高的實用價值．

4 結(jié) 語

應(yīng)用所建立的 LAMP方法檢測沙門氏菌 invA基因，在檢出時間、靈敏度方面優(yōu)于其他血清學(xué)及PCR方法，通過富集增殖后進(jìn)一步提高了靈敏度和檢出率，降低了復(fù)雜食品原料對檢出率的影響，LAMP方法還可通過眼觀進(jìn)行判定，適用于基礎(chǔ)應(yīng)用．沙門氏菌 invA基因檢測的 LAMP方法，可作為動物沙門氏菌感染、進(jìn)出口檢疫、食品及其原料中沙門氏菌污染快速檢測及其安全性評價的手段．

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