胡廷尖，李 倩，郝向舉，王雨辰，劉士力

(1.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州 313001；2.全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，北京 100026)

施其樂為浙江北部地區(qū)主要漁用藥，主要成分為戊二醛和苯扎氯銨。戊二醛為養(yǎng)殖魚類的體表消毒藥物，苯扎氯銨是一種陽離子表面活性劑，屬非氧化性殺菌劑，主要適用于因水質(zhì)惡化引起的水霉、出血、腸炎、爛鰓、赤皮等疾病的預(yù)防和治療。生產(chǎn)實(shí)踐中對施其樂的用量沒有具體依據(jù)，僅根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和建議量使用，缺乏科學(xué)依據(jù)。國內(nèi)關(guān)于施其樂的研究報道較少，僅王雨辰等[1]進(jìn)行了施其樂對泥鰍Misgurnus anguillicaudatus水花、夏花苗種的急性毒性的研究，有關(guān)施其樂對泥鰍遺傳毒性報道還未見報道。

微核測試法是20世紀(jì)70年代由HEDDLE(1973)和SCHMID(1975)分別獨(dú)自創(chuàng)立的一種檢測化學(xué)物質(zhì)毒性的常規(guī)方法[2]。該方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于檢測和監(jiān)察各種理化因子對機(jī)體的致癌、致突變效應(yīng)[3]。泥鰍的血紅細(xì)胞具核，在外來誘變劑的作用下會出現(xiàn)微核和各種核畸變現(xiàn)象。近年來學(xué)者將泥鰍作為研究水體污染的材料，取得較好效果[4-6]。泥鰍在實(shí)驗(yàn)室易于飼養(yǎng)，分布廣泛，取材容易，易于涂片，且具有較高的敏感性等優(yōu)點(diǎn)，因而常被用于檢測水體的污染情況[7]。因此，可用泥鰍作為評價水體污染和化學(xué)物質(zhì)對水生生物遺傳損害及毒理效應(yīng)的指示生物[8]。

本試驗(yàn)的試驗(yàn)材料為泥鰍，以施其樂建議用量為基礎(chǔ)，研究施其樂(規(guī)格為20%濃戊二醛溶和5%烴銨鹽類)對泥鰍紅細(xì)胞核異常產(chǎn)生的影響，從細(xì)胞遺傳學(xué)角度探討施其樂對泥鰍的毒性效應(yīng)，為研究施其樂對水生動物的毒性提供試驗(yàn)依據(jù)，也為合理使用施其樂提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

泥鰍購于湖州市某農(nóng)貿(mào)市場，選取體重10.0～14.5 g、體長11.0～14.0 cm的健康個體。在曝氣的自來水中暫養(yǎng)4 d，實(shí)驗(yàn)時選用體重相近、體表無損、健康活潑的個體作為試驗(yàn)材料，試驗(yàn)水溫23～28℃。

1.1.2 主要試劑

施其樂購自湖南坤源生物科技有限公司，規(guī)格為20%戊二醛+5%烴銨鹽類。用蒸餾水配置成100 mg/L的母液，用時稀釋成所需濃度。Giemsa染液購自sigma公司，使用前用0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.8)稀釋10倍。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)不同質(zhì)量濃度施其樂處理組5組，分別為0.2 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、6mg/L和8 mg/L(質(zhì)量濃度依次為建議治療用量的1、10、20、30和40倍)，設(shè)對照組1組。實(shí)驗(yàn)?zāi)圉q放在裝有10 L曝氣自來水的水族箱內(nèi)，設(shè)3個重復(fù)，暴露時間為4 d。為避免殘餌和糞便對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)期間不投食，為避免實(shí)驗(yàn)期間施其樂濃度的變動，染毒期間不換水。染毒時間為24 h、48 h、72 h和96 h 4個時間段，對照組和實(shí)驗(yàn)組各投放20尾泥鰍。

1.2.2 染色和觀察

用常規(guī)血圖片制作方法制片。取試驗(yàn)?zāi)圉q，斷尾取血，制成血涂片，自然晾干，用甲醇固定10 min，水洗，晾干，再用磷酸緩沖液(pH 6.8)稀釋的Giemsa染液染色15～20 min，水洗，晾干，置于Olympus顯微攝影儀下拍照觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

每個涂片隨機(jī)觀察3 000個以上的紅細(xì)胞，記錄具有核異常的紅細(xì)胞數(shù)量；核異常細(xì)胞率(‰)=具有核異常的細(xì)胞總數(shù)/觀察細(xì)胞的總數(shù)×1 000‰。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS進(jìn)行t檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 施其樂對泥鰍外周血紅細(xì)胞核異常的誘導(dǎo)

泥鰍正常的紅細(xì)胞呈圓形或橢圓形，本實(shí)驗(yàn)中觀察到的異常細(xì)胞包括微核細(xì)胞、核質(zhì)外凸、核質(zhì)內(nèi)凹、細(xì)胞形狀不規(guī)則、膜溶解、無核紅細(xì)胞、核質(zhì)斷裂等異常情況(圖 1)。

2.2 不同濃度施其樂對泥鰍外周血紅細(xì)胞的影響

由表1可知：對照組泥鰍在實(shí)驗(yàn)期間平均核異常率為8.53‰，6 mg/L組平均核異常率最高，為22.46‰，為對 照組平均值的2.63倍。所有處理組中，6 mg/L組在96 h達(dá)到峰值(28.326‰)。施其樂均能不同程度地引起泥鰍紅細(xì)胞核異常的產(chǎn)生，除0.2 mg/L組在24 h和72 h與對照組無顯著差異外，其余處理組泥鰍紅細(xì)胞核異常率和對照組差異顯著，其中，高濃度組(4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L)達(dá)極顯著水平。

圖1 正常紅細(xì)胞和異常紅細(xì)胞Fig.1 Normal cell and nuclear abnormalities

表1 施其樂誘導(dǎo)的泥鰍紅細(xì)胞核異常(‰)Tab.1 Inducement of glutaraldehyde on abnormal nucleas in loach red blood cells

2.3 不同處理時間對泥鰍外周血紅細(xì)胞核異常的誘導(dǎo)

由圖2可知，在各取樣時間點(diǎn)，泥鰍紅細(xì)胞核異常率隨著濃度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，各取樣時間點(diǎn)均在6 mg/L達(dá)到最大值然后下降；同一濃度處理下，泥鰍紅細(xì)胞核異常率均隨著處理時間的延長而升高，表現(xiàn)為明顯的時間-效應(yīng)關(guān)系。方差分析結(jié)果表明，各處理組之間差異表現(xiàn)較為復(fù)雜，但和對照組相比差異均顯著(除0.2 mg/L組在24 h外)。該圖表明，6 mg/L濃度組對泥鰍紅細(xì)胞核異常的誘導(dǎo)最為明顯。

圖2 施其樂對泥鰍紅細(xì)胞核異常的影響Fig.2 The effect of glutaraldehyde on nuclear abnormalities in loach red blood cells

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，施其樂均能不同程度地誘導(dǎo)泥鰍紅細(xì)胞核異常的產(chǎn)生，原因可能是施其樂引起泥鰍紅細(xì)胞染色體損傷，使染色體斷裂、丟失、結(jié)構(gòu)破壞從而形成核異常[9-10]。

各染毒時間段內(nèi)，泥鰍紅細(xì)胞核異常率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在6 mg/L施其樂濃度處理后的取樣時間段，核異常達(dá)到峰值，8 mg/L反而下降，原因可能有兩點(diǎn)：一是核異常變化趨勢同濃度范圍有一定的相關(guān)性，當(dāng)處理濃度大于某個濃度范圍，高劑量的誘變劑會影響、抑制甚至終止細(xì)胞正常的分裂活動，導(dǎo)致這些核異常細(xì)胞死亡[11-13]；二是同泥鰍機(jī)體修復(fù)能力有關(guān)。在開始暴露于高劑量誘變劑施其樂溶液中時，泥鰍對施其樂的適應(yīng)能力較差，出現(xiàn)明顯的跳躍、翻騰、粘液分泌過多和呼吸困難的情況，隨著時間的延長，泥鰍的適應(yīng)能力逐漸增強(qiáng)，機(jī)體的調(diào)整能力逐漸發(fā)揮作用，染色體突變能被機(jī)體修復(fù)能力修復(fù)，從而降低了核異常率[14]。

血液指標(biāo)是良好的生理、病理和毒理學(xué)指標(biāo)，廣泛地用來評價魚類的健康狀況、營養(yǎng)狀況及環(huán)境適應(yīng)能力[15-16]。魚類機(jī)體在受到環(huán)境脅迫時，外周血細(xì)胞特征性指標(biāo)會出現(xiàn)明顯變化，如數(shù)量、形態(tài)、遺傳特性等[17]。本實(shí)驗(yàn)最低處理濃度為建議用量，高于建議用量時均能引起泥鰍紅細(xì)胞核異常率的升高，且高濃度組的泥鰍隨著時間的增加有個別泥鰍死亡，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果來看，施其樂雖為常用漁藥之一，但在使用時要嚴(yán)格用量，要在安全使用濃度內(nèi)，對使用方法和事項(xiàng)嚴(yán)格規(guī)范，超出一定的范圍會引起泥鰍的遺傳損傷，避免污染養(yǎng)殖水體。

本研究中的核異常率與施其樂質(zhì)量濃度具有一定的正相關(guān)關(guān)系，在72 h內(nèi)各處理組微核率均隨著施其樂濃度的升高而增加，表明以核異常率作為施其樂脅迫下泥鰍紅細(xì)胞毒害程度的指標(biāo)具有可行性。核異常率在施其樂質(zhì)量濃度4 mg/L時與對照組出現(xiàn)極顯著差異，表明此質(zhì)量濃度對染色體、細(xì)胞核的破壞作用已經(jīng)明顯?？蓪? mg/L施其樂質(zhì)量濃度作為發(fā)生遺傳損傷的閾值，在生產(chǎn)實(shí)踐中使用時建議用量在4 mg/L以下。

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