劉志剛，楊成彬，2，閆 浩，2，劉曉宇，2，夏立新，李 荔，2

1)深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院過敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所，深圳518060;2)深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳518060

食物過敏反應(yīng)是一種速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，由過敏原特異性IgE抗體介導(dǎo)，當(dāng)其作用于肥大細(xì)胞時(shí)，可引起肥大細(xì)胞脫顆粒釋放活性介質(zhì)組胺、花生四烯酸和5－羥色胺等;當(dāng)其作用于體內(nèi)其他免疫細(xì)胞和靶器官時(shí)，可引起身體出現(xiàn)過敏反應(yīng)癥狀［1］.在食物過敏人群中，約30%的人對(duì)花生致敏［2］，李宏等［3］對(duì)北京協(xié)和醫(yī)院就診的過敏患者的調(diào)查表明，約有4%的病人對(duì)花生過敏，花生過敏在嚴(yán)重情況下可能危及患者生命.李秀敏等［4-7］曾成功建立了花生過敏模型并進(jìn)行了治療性的研究，但采用的過敏原只是單一的過敏原分子，不能全面反應(yīng)人花生過敏的真實(shí)途徑.目前，國內(nèi)尚未有建立花生過敏模型的報(bào)道，為此，本研究采用灌胃花生粗蛋白方法對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行致敏，探討小鼠花生過敏的發(fā)病機(jī)理，為后續(xù)研究及開發(fā)治療花生過敏藥物提供良好的動(dòng)物模型.

1 材料與方法

1.1 材料

5～6周齡雌性Balb/c小鼠 (SPF級(jí))購于中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心;辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗IgE抗體 (HRP-IgE)和HRP-IgG2a購于美國SouthBiot公司;組胺檢測(cè)試劑盒購自美國R＆D公司;劉氏染液和伊文思藍(lán)購于珠海貝索生物技術(shù)有限公司;IL-4、IL-6、IL-10和IFN-γ細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒購于美國Biolegend公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 花生粗提蛋白的制備

1.3 小鼠的致敏和激發(fā)

16只Balb/c小鼠分為PBS對(duì)照組和花生致敏模型組 (簡(jiǎn)稱模型組)，每組8只.致敏方式:模型皮下注射致敏兩次，間隔3周，每次注射100 μg花生粗蛋白 (crude peanut extract protein，CPE)和1 mg氫氧化鋁佐劑;第2次免疫一周后，皮下注射200 μg CPE進(jìn)行激發(fā).PBS對(duì)照組用相同體積溶液的PBS溶液代替花生粗蛋白，其他與模型組相同.

1.4 小鼠尾靜脈注射伊文思藍(lán)

小鼠激發(fā)前，對(duì)照及實(shí)驗(yàn)組分別隨機(jī)取出2只小鼠，尾靜脈注射質(zhì)量濃度為5 g/L的伊文思藍(lán)100 μL，然后立即皮下注射200 μg CPE進(jìn)行激發(fā)，30～40 min后觀察小鼠足部顏色變化.

1.5 眼球取血與腹腔灌洗

鼠眼球取血處死，血液滴入體積分?jǐn)?shù)為2%肝素處理的抗凝管中，3 000 r/min離心10 min，取血清;固定小鼠于解剖板上，剪開皮膚露出腹膜，從腹腔一側(cè)注入3 mL的D-hanks液，輕輕按摩約2 min;在腹腔正中剪開一小口，從小口插入玻璃管反復(fù)沖洗腸系膜，用注射器吸取灌洗液于離心管中，取200 μL進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù);剩余部分 1 000 r/min離心10 min，取上清液于另一新的離心管，－20℃保存?zhèn)溆?用3 mL PBS重懸剩余細(xì)胞，取200 μL涂于色甘酸鈉預(yù)處理的載玻片上，自然風(fēng)干，劉氏染色 (A液15 s，B液30 s)，顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類統(tǒng)計(jì)，觀察肥大細(xì)胞形態(tài)變化.

1.6 空腸組織H＆E切片

取小鼠空腸，剪成0.5 cm小段，用體積分?jǐn)?shù)為10%中性甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，H＆E染色.光學(xué)顯微鏡下觀察腸道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和病理變化情況.

1.7 透射電鏡觀察腸道組織超微結(jié)構(gòu)病理變化

將空腸組織切成1 mm×1 mm×1 mm大小組織塊，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為3%的戊二醛和體積分?jǐn)?shù)為1%的四氯化鋨進(jìn)行雙固定，常規(guī)環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，超薄切片，透射電鏡觀察并拍照.

1.8 血清中IgE、IgG2a、組胺及細(xì)胞因子的測(cè)定

將1 μg/mL花生蛋白抗原加入到96孔酶標(biāo)板中，100 μL每孔，4℃包被過夜.PBST洗板5次，加入封閉液，37℃孵育2 h;PBST洗板5次，加入用體積分?jǐn)?shù)為5%的小牛血清PBS稀釋液，每孔100 μL，37℃孵育2 h;PBST洗板5次，每孔加入100 μL已稀釋的羊抗鼠HRP-IgE(1∶2 000)或羊抗鼠HRP-IgG2a(1∶5 000)，37℃孵育2 h;PBST洗板5次，加入TMB底物，37℃避光顯色15 min，加入終止液終止反應(yīng)，測(cè)OD450值.

參照組胺及細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒說明書，酶聯(lián)免疫吸附法分別測(cè)定血清的細(xì)胞因子和組胺含量.

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物與對(duì)照組之間比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析.設(shè)n為各組樣本數(shù)，P為t檢驗(yàn)概率值，則P＜0.05代表差異顯著.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 花生粗蛋白SDS-PAGE分析

提取的花生粗蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果見圖1.由圖1可知，在55～70 kDa(1 Da=1 u)之間蛋白量最多，花生蛋白中最主要過敏原Ara h1(相對(duì)分子質(zhì)量63.5 kDa)位于這個(gè)區(qū)間內(nèi).BCA法測(cè)定花生粗蛋白濃度，定量5 mg/mL分裝，用于動(dòng)物致敏.

（一）對(duì)于“新聞閱讀”專題和“新詩研究”專題，由于文本內(nèi)容理解難度不大，可以用1—2節(jié)課的時(shí)間，直接開展教學(xué)。依照先閱讀，后分析的原則，由學(xué)生首先帶著問題進(jìn)行閱讀，而后進(jìn)行小組討論研究，最后小組匯報(bào)的形式，完成專題研究的過程。

2.2 激發(fā)后小鼠體征觀察

激發(fā)后，模型組小鼠相對(duì)于PBS對(duì)照組，模型組小鼠出現(xiàn)煩躁不安，腹瀉，精神萎靡，撓頭搔耳，呼吸急促等癥狀.

圖1 SDS-PAGE鑒定花生粗蛋白成分Fig.1 SDS-PAGE of peanut crud protein

2.3 小鼠血管通透性的變化

PBS組和花生致敏模型組小鼠尾靜脈注射伊文思藍(lán)，接著皮下注射花生粗蛋白30 min后，觀察小鼠足部顏色的變化，花生過敏組小鼠的足部出現(xiàn)明顯的藍(lán)色，且足部組織充血水腫，而對(duì)照組未見明顯變化，表明花生過敏模型組小鼠血管通透性明顯增強(qiáng) (圖2).

圖2 PBS組與花生致敏模型組血管通透性觀察Fig.2 Blood vessel permeation observation of PBS group and model group

2.4 腹腔灌洗液炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)

用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)兩組Balb/c小鼠腹腔灌洗液的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)統(tǒng)計(jì)，并用劉氏染液染色，根據(jù)細(xì)胞核大小及細(xì)胞核分葉數(shù)等特征區(qū)分各種炎癥細(xì)胞，分類統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明模型組中炎癥細(xì)胞總數(shù)明顯升高，其中肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞都呈現(xiàn)顯著升高(P＜0.01)，而中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞無明顯的變化(P＞0.05)(圖3和圖4).花生過敏組腹腔灌洗液中肥大細(xì)胞明顯增大，數(shù)目明顯增多，細(xì)胞膜出現(xiàn)褶皺狀，在致敏組活化的肥大細(xì)胞周圍有明顯的顆粒狀物質(zhì)存在，表明肥大細(xì)胞已出現(xiàn)脫顆粒.

圖3 腹腔灌洗液劉氏染色 (↑指示肥大細(xì)胞，×100)Fig.3 Irrigating solution abdominal cavity were stained by Liu'staining solution(↑:mast cell，manification ×100)

圖4 腹腔細(xì)胞分類與計(jì)數(shù)Fig.4 Classification and count of the cells of abdominal cavity were classified and counted

2.5 小鼠空腸組織病理變化

空腸下端H＆E切片顯示，PBS組腸黏膜結(jié)果清晰，腸絨毛排列整齊，絨毛無明顯損傷，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);而模型組與PBS對(duì)照組相比，花生過敏模型組腸黏膜出現(xiàn)輕度糜爛，排列不整，腸絨毛損傷，呈現(xiàn)以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象.表明花生過敏原引起了模型組出現(xiàn)腸道黏膜病變 (圖5).通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組微絨毛排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，腸緊密連接結(jié)構(gòu)清晰，腸上皮細(xì)胞可見大量線粒體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，而過敏模型組腸微絨毛絨毛已嚴(yán)重受損，排列紊亂、斷裂、缺失，腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞間緊密連接擴(kuò)大，可見肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn) (圖6).

2.6 血清中特異性的IgE和IgG2a水平的改變

圖5 空腸下端病理切片 (H＆E染色，×40)Fig.5 The pathological section of ileum(H＆E staining，manification ×40)

圖6 透射電鏡觀察空腸下端病理切片 (TEM，×23 000)Fig.6 Observation of the pathological section of ileum by TEM(TEM，×23 000)

酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中的花生過敏原特異性IgE和IgG2a的水平，模型組 (0.56±0.22，n=8)相對(duì)于對(duì)照組 (0.17±0.03，n=8)，血清中IgE明顯上升 (P＜0.01)，IgG2a水平模型組(0.23±0.03，n=8)較對(duì)照組 (0.56±0.02，n=8)明顯下降(P＜0.01)(圖7).說明花生過敏原引起體內(nèi)特異性IgE升高，而IgE是活化肥大細(xì)胞介導(dǎo)速發(fā)型過敏反應(yīng)前提.IgG2a的下調(diào)表明過敏原引起小鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)偏向于Th2型反應(yīng).

圖7 血清中IgE與IgG2a抗體水平Fig.7 The levels of IgE and IgG2a in blood serum

2.7 血清組胺和細(xì)胞因子的變化

模型組血清中的 Th2型的細(xì)胞因子 (IL-4，16.9±1.34，P ＜0.01;IL-5，16±3.51，P ＜0.05;IL-6，121.7±11.84;n=6)較PBS對(duì)照組 (IL-4，9.1±1.42;IL-5，8.3±1.15;IL-6，37.4±4.84，P＜0.01;n=6)出現(xiàn)明顯上升.Th1型的血清細(xì)胞因子模型組 (IFN-γ，133.8±5.45，P ＜0.01;n=6)較PBS組 (IFN-γ，185.4±13.63;n=6)出現(xiàn)顯著下調(diào)，表明花生過敏原通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)，引起偏向于Th2的過敏反應(yīng) (圖8).在模型組中血清組胺含量 (27.7±4.29，P＜0.01;n=6)都明顯高于對(duì)照組(13.4±2.11;n=6)，說明模型組體內(nèi)的肥大細(xì)胞的活化，引起了脫顆粒，并釋放組胺，引起速發(fā)型過敏反應(yīng).

圖8 血清中細(xì)胞因子水平Fig.8 The levels of cytokine in blood serum

3 討論

花生過敏是速發(fā)型超敏反應(yīng)，可以影響全身許多臟器，如口腔、消化道、心血管和皮膚等，引起臨床各種變態(tài)反應(yīng)癥狀［8］.花生過敏反應(yīng)是IgE介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)，花生總蛋白中含有多種過敏原蛋白成分，包括主要致敏蛋白組分Ara h1和Ara h2，次要致敏蛋白組分Ara h4、Ara h5、Ara h6、Ara h7和Ara h8，它們都可以與特異性IgE結(jié)合并誘導(dǎo)人體過敏反應(yīng)，不同的過敏患者可能對(duì)不同的花生過敏原蛋白成分產(chǎn)生過敏反應(yīng)［9-10］.Balb/c小鼠常用于建立食物過敏模型，相對(duì)Ganeshan K等報(bào)道的花生過敏模型的建立方法，本實(shí)驗(yàn)采用去除脂肪和多糖類物質(zhì)中的花生粗蛋白 (CPE)對(duì)小鼠進(jìn)行致敏，其致敏性強(qiáng)，更能反映花生作為食品引起的過敏反應(yīng)［11］，全面表現(xiàn)花生過敏的真實(shí)情況，且Balb/c小鼠相對(duì)易得，便于實(shí)驗(yàn)研究.

Mosmann T R等［12］發(fā)現(xiàn)按照細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的種類和量的不同，提出了Th1/Th2平衡理論，可將細(xì)胞因子的產(chǎn)生分為Th1型和Th2型.Th1型是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和遲發(fā)型的變態(tài)反應(yīng)，主要包括IL-2、IFN-γ和TNF-α等，Th2型主要介導(dǎo)的是速發(fā)型過敏反應(yīng)及I型超敏反應(yīng)，主要包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-9和IL-13等.本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了血清中的細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)花生粗蛋白引起了Balb/c小鼠血清中IL-4、IL-5和IL-6含量明顯上升，IFN-γ出現(xiàn)下降，表明花生粗蛋白上調(diào)了Th2細(xì)胞因子水平，抑制了Th1因子的水平，導(dǎo)致小鼠體內(nèi)Th1/Th2失衡.

肥大細(xì)胞是過敏反應(yīng)中的核心細(xì)胞，在I型超敏反應(yīng)中是最重要的效應(yīng)細(xì)胞，當(dāng)攝入的過敏原進(jìn)入機(jī)體后，抗原會(huì)誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性的抗體IgE、sIgE與肥大細(xì)胞表面的Fc受體相結(jié)合，從而使肥大細(xì)胞處于致敏狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體再次接觸到抗原時(shí)，肥大細(xì)胞表面的Fc受體發(fā)生募集反應(yīng)，激活肥大細(xì)胞的內(nèi)部傳導(dǎo)信號(hào)，較短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯和肝素等炎性介質(zhì)，進(jìn)而引起平滑肌收縮、毛細(xì)血管擴(kuò)張等一些過敏反應(yīng)癥狀，造成皮膚、消化道和呼吸道過敏反應(yīng)，甚至全身性過敏反應(yīng)［13-15］.

本實(shí)驗(yàn)對(duì)血清中的組胺和花生特異性IgE進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)花生致敏組中兩者含量都明顯上升，這是小鼠發(fā)生過敏反應(yīng)的重要指標(biāo)之一，對(duì)應(yīng)用小鼠動(dòng)物模型檢測(cè)花生過敏原有重要意義.在對(duì)小鼠血管通透性檢測(cè)中，模型組的血管通透性明顯增強(qiáng)，提示肥大細(xì)胞釋放的組胺等介質(zhì)引起了小鼠血管壁的擴(kuò)張，從而引起通透性明顯增強(qiáng).通過光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察腸道病理切片，發(fā)現(xiàn)模型組出現(xiàn)腸黏膜水腫、腸上皮損傷、腸絨毛斷裂等一系列腸道病理變化，說明花生過敏會(huì)降低腸道的吸收能力和增強(qiáng)其通透性.向軍儉等［16］報(bào)道脫顆粒肥大細(xì)胞的體積較正常肥大細(xì)胞大，胞內(nèi)有很多致密小顆粒，正常肥大細(xì)胞呈圓球形，輪廓清楚完整;脫顆粒細(xì)胞形態(tài)變的不規(guī)則，表面出現(xiàn)一些空洞，輪廓模糊不清.本實(shí)驗(yàn)中對(duì)腹腔灌洗液中的肥大細(xì)胞進(jìn)行劉氏染色，結(jié)果顯示，在花生過敏組的腹腔肥大細(xì)胞出現(xiàn)明顯增大，細(xì)胞周圍分泌物明顯增多，顯示肥大細(xì)胞呈活化狀態(tài).綜上研究可知，本實(shí)驗(yàn)提供了一種花生過敏建模的方法，并對(duì)花生過敏的發(fā)病機(jī)理及病理特征進(jìn)行了研究，為花生過敏的預(yù)防和治療奠定了理論基礎(chǔ).

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