任海松，張秀美，崔言順，許傳田，楊少華，李建亮，胡北俠*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東泰安 271018;2.山東農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所;3.山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東 濟南 250100)

雞傳染性支氣管炎是由(Infectious bronchitious，IB)雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitious-Virus，IBV)引起的一種急性、高度接觸性傳染性疾病。該病原是冠狀病毒科、冠狀病毒屬第三抗原群的代表種［1］。是我國規(guī)定的禽類二類傳染病之一。本病能夠在雞的呼吸道、消化道、腎臟、輸卵管、腺胃等多個部位復制，能夠?qū)е码u群生產(chǎn)效益的大幅度下降，所造成的損失往往遠遠大于直接死亡引起的損失，給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的危害［2］。

S1基因是IBV的主要免疫原基因，S1蛋白與病毒的免疫保護性有關(guān)，并且S1蛋白能夠誘導機體產(chǎn)生病毒的中和抗體、血凝抑制抗體及細胞介導的免疫應答［3，4］反應等。與病毒的抗原性和血清型有重要的關(guān)系。血清中和試驗(VN)是一種區(qū)別不同血清型差別的最敏感的方法［5，6］。本實驗通過雞胚交叉中和試驗8株山東省分離株進行血清學分型，并結(jié)合S1基因序列分析，探討兩者之間的關(guān)系，旨在為臨床疫苗應用和病毒防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒分離與鑒定

對疑似IBV的病料按常規(guī)方法處理后接種9－11日齡SPF雞胚，37℃培養(yǎng)，觀察雞胚病變，并通過新城疫病毒干擾試驗，RT－PCR等方法對病毒進行鑒定。8個IBV分離株的背景資料及基因序列GenBank登錄號見表1。

1.2 引物、菌種、質(zhì)粒和試劑

S1基因引物序列參考文獻［6］，由上海生物工程有限公司合成。p EASY－T1 載體，購自北京全式金公司。PrimeScript TM One Step RT－PCR Kit、Trizol和Gel Ext raction Kit，均購自大連寶生物工程有限公司。DH5α菌種為本實驗室保存。

1.3 病毒增殖及RNA的提取

將IBV分離株分別接種9－11日齡的SPF雞胚，37℃培養(yǎng)72 h后(棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚)無菌收集尿囊液，離心后，按TRIzol試劑(Invitrogen)說明書提取病毒基因組RNA。

1.4 IBV分離株S1基因擴增、克隆測序以及核苷酸序列的比較分析

應用RT－PCR 方法擴增S1基因，將回收后的PCR 產(chǎn)物與pMD18－T 載體進行連接反應后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。經(jīng)菌液PCR 初步鑒定后，委托北京六和華大基因科技股份有限公司測序。利用lasergene7.0生物軟件，將IBV分離株S1基因分別與GenBank中參考株S1基因核苷酸序列及推導的氨基酸序列進行同源性比較和系統(tǒng)進化分析。

表1 山東省商業(yè)雞群中分離的8株IBV分離株的分離背景Table 1 Eight IBV strains isolated from commercial flocks in Shandong province of China

1.5 IBV疫苗株(491和H120)和分離株陽性血清的制備

［7］方法，用SPF雞分別制備IBV疫苗株(491，H120)和分離株的陽性血清。

1.6 IBV雞胚半數(shù)感染量(EID50)的測定

將IBV分離株和疫苗株用0.01 M PBS緩沖液(PH7.2)進行10倍倍比稀釋，取10－4～10－85個稀釋度分別接種9～11日齡SPF雞胚5枚，0.2 mL/胚，37℃孵育至18日齡，每日照胚2次，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，根據(jù)雞胚死亡及病變情況，按Reed–Muench法計算EID50［8］。

1.7 雞胚中和試驗

參考文獻［9］方法，采用固定病毒稀釋血清的方法，陽性血清進行2倍倍比比稀釋，每個稀釋度分別與等體積200EID50的病毒液混勻，室溫作用60 min后接種9～11日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚，每稀釋度接種5枚，置37℃培養(yǎng)至18日齡，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，根據(jù)雞胚死亡及病變進行結(jié)果判定，以能使50%以上雞胚保護的血清最高稀釋倍數(shù)為血清的中和效價。抗原相關(guān)性的計算按免疫學方法進行:相關(guān)系數(shù)(R)源血清效價1/同源血清效價1，r2=異源血清效價2/同源血清效價2［10］。R＞80%時為同一血清型，R在25%和80%之間為同一血清型的不同亞型，R≤25%時為不同血清型。

2 結(jié)果

2.1 S1基因序列測定結(jié)果以及與參考株遺傳進化分析

8個IBV分離株S1基因序列測定結(jié)果顯示:其中6個IBV分離株S1基因ORF長度為1620個bp，分別編碼540個氨基酸(包括蛋白酶裂解位點);分離株SDTA06111S1基因ORF長度為1611個bp，編碼537個氨基酸;CK/CH/SD09/005毒株S1基因ORF長度為1640個bp，編碼546個氨基酸;8個分離株之間S1基因核苷酸序列及其推導的氨基酸序列的同源性分別為65.6% ～99.6%和61.0% ～99.1%;與參考毒株核苷酸序列以及推導的氨基酸序列的同源性分別介于62.4% ～99.4%和51.9% ～98.7%。8個分離株與疫苗株H120和491核苷酸序列同源性分別介于:65.5% ～99.3%和78.2% ～78.5%(見表3);以疫苗株H120為參考，發(fā)現(xiàn)8個IBV分離株S1基因存在廣泛的基因突變和氨基酸替代現(xiàn)象，其中分離株CK/CK/SD09/005在98－99(G)、142－143(S)、288－289(QKEP)，375－376(S)位核苷酸處共插入了7個氨基酸(圖略)。

圖1 8個IBV分離株與參考毒株S1基因遺傳進化樹Fig.1 Phylogenetic tree generated from the nucleotide sequences of the S1 genes of published IBV strains obtained from GenBank and eight IBV isolates

根據(jù)S1基因核苷酸序列繪制的遺傳進化樹顯示(圖1):8個IBV分離株(下劃線為分離株)和26個參考毒株形成4個進化群。其中SDTA0611與H120等在內(nèi)的21個分離株構(gòu)成了基因I群，491、UK793和J2組成基因II群;包括SDLY0612在內(nèi)的6個分離株與三個參考毒株構(gòu)成基因III群，分離株CK/CH/SD09/005和參考株TC07－2(GQ265948，中國廣東分離株)形成獨立的第IV基因群。

2.2 雞胚交叉中和試驗

IBV疫苗株H120、491和8個分離株雞胚交叉中和試驗結(jié)果見表2。從表2可見，疫苗株H120和491不能交叉中和，說明二者分屬不同的血清型;疫苗株陽性血清對IBV分離株的中和試驗結(jié)果表明:8個分離株中有6個分離株(分別是S1，S2，S3，S4，S7和S8)可以被H120陽性血清中和，3個分離株可以同時被H120和491陽性血清中和(分別是S3，S7和S8)，2個分離株(S5和S6)不能被H120或491陽性血清中和。8個IBV分離株陽性血清對H120和491的中和試驗結(jié)果是:H120可以被5個分離株陽性血清中和(S1，S2，S3，S4和S8)，491可以被除S6之外的7個分離株陽性血清中和。疫苗株和8個分離株之間交叉中和試驗結(jié)果顯示:H120和5個分離株(S1、S2、S3、S4和S8)之間具有雙向交叉中和反應，與S7僅有單向交叉中和作用;491和3個分離株(S3、S7和S8)之間具有雙向交叉中和反應，與4個分離株(S1、S2、S4和S5)之間僅有單向交叉中和反應。

表2 IBV分離株與疫苗株491，H120的中和價Table 2 Neutralization titers between IBV isolates and 491，H120

2.3 分離株與疫苗株的抗原相關(guān)系數(shù)

表3 IBV分離株和疫苗株491，H120的抗原相關(guān)系數(shù)Table 3 Antigenic relatedness values(R)and S1 gene nucleotide identity between IBV isolates and 491，H120 strains

3 討論

S1基因作為重要的免疫原基因，并具有高度的變異性。S1基因遺傳進化分析顯示，8個分離株中6個毒株與常用疫苗株H120、MA5和491遺傳距離較遠，形成獨立的基因III群，也是目前山東省IBV的主要基因型。S1基因同源性分析結(jié)果表明，分離株與H120和491的同源性分別在65.5% ～99.3%和65.4% ～78.5%之間;以H120為參考株，多數(shù)分離株都存在著氨基酸的插入現(xiàn)象，其中CK/CK/SD09/005在98－99(G)、142－143(S)、288－289(QKEP)，375－376(S)位核苷酸處共插入了7個氨基酸，由于廣泛的基因突變和多個氨基酸的插入，分離株CK/CK/SD09/005除與TC07－2同源性較高(98.7%)外，與Gen-Bank上登錄的IBV序列同源性均低于70%。此外，CK/CK/SD09/005與H120和491的S1基因同源性分別為65.5%和65.4%，抗原相關(guān)系數(shù)分別為18%和9%，因此推測CK/CK/SD09/005可能源自疫苗株和野毒株之間的基因重組。

雞胚中和試驗和抗原相關(guān)系數(shù)計算結(jié)果發(fā)現(xiàn):IBV疫苗株和部分分離株之間僅能發(fā)生單向中和試驗或能夠雙向交叉中和的毒株之間抗原相關(guān)系數(shù)小于25%(屬于不同血清型)，說明IBV存在多個中和性抗原表位，可以通過部分中和表位的改變產(chǎn)生新的血清型。8個IBV分離株中，僅有SDWF0608、SDLY0612、SDLY0701三個分離株與疫苗株H120同屬Mass血清型的不同亞型，其它5個分離株與H120和491屬于不同的血清型，抗原相關(guān)性均低于25%，本研究結(jié)果從體液免疫的角度解釋了臨床上雞群免疫H120或491疫苗后仍然經(jīng)常發(fā)生IBV感染的原因，也提示山東省目前IBV流行株存在多個血清型，必須在全面鑒定這些流行株血清型的基礎(chǔ)上進行多價疫苗的研制。

結(jié)合S1基因序列同源性和抗原相關(guān)性結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)分離株SDTA06111與H120同屬基因I群，且S1基因核苷酸序列的同源性分別達到99.3%，但是二者抗原相關(guān)系數(shù)僅18%，不屬于同一個血清型;分離株SDLY0612與H120的抗原相關(guān)系數(shù)最高(70.71%)，但是兩者S1基因序列的同源性僅78.2%，說明S1基因同源性和血清型沒有明顯的相關(guān)性，IBV可能通過少數(shù)基因突變導致中和性抗原表位的改變，從而產(chǎn)生新的血清型。

綜上所述，由于IBV基因突變、插入、缺失和重組并不斷產(chǎn)生新的血清型，導致生產(chǎn)上疫苗免疫失敗，必須加強對IBV流行株的監(jiān)測，并采取包括生物安全在內(nèi)的各項綜合防控措施才能有效預防IB的發(fā)生。

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