田功太，劉 飛，段登選，杜興華，張金路，陳述江，張明磊，王 慧

(1.山東省淡水水產(chǎn)研究所，山東濟(jì)南 250013;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271018)

近年來，海參(Apostichopus japonicus Selenka)養(yǎng)殖業(yè)在北方發(fā)展迅速。由于海參的養(yǎng)殖周期長(zhǎng)，隨著排泄物和殘餌的積累，有害微生物滋生繁殖，水質(zhì)容易惡化。通過傳統(tǒng)的換水、倒池或藥物等途徑來防控海參疾病，不僅會(huì)帶來機(jī)械損傷和加大勞動(dòng)強(qiáng)度;還會(huì)帶來環(huán)境污染和食品安全等一系列不利于海參養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的問題。改善養(yǎng)殖環(huán)境和調(diào)控水質(zhì)成為海參養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的關(guān)鍵問題［1］。EM菌是由光合細(xì)菌、乳酸菌、芽孢桿菌、消化細(xì)菌等多種有益菌群組成的，其特點(diǎn)是可在厭氧光照或好氧黑暗條件下利用有機(jī)物或硫化氫等代謝產(chǎn)物作供氫體兼碳源，進(jìn)行不放氧光合作用［2－5］。大量研究證明，EM菌能有效抑制動(dòng)物腸道的有害菌繁殖;同時(shí)，又因EM菌含高蛋白和平衡氨基酸而成為海參水產(chǎn)動(dòng)物育苗期的高效餌料;EM菌可在凈化水質(zhì)、降低氨氮、亞硝酸鹽等有毒物質(zhì)濃度、提高動(dòng)物免疫力和實(shí)現(xiàn)健康養(yǎng)殖方面發(fā)揮重要作用。EM菌還具有成本低、無毒副作用、不污染生態(tài)環(huán)境等特點(diǎn)，因而，在水產(chǎn)養(yǎng)殖以及鹽堿地等池塘改良養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物方面得到廣泛應(yīng)用［6－21］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

海參(Apostichopus japonicus Selenka)養(yǎng)殖，在山東省淡水所東營市水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行，EM菌為中日合資生產(chǎn)的EM原液，登記號(hào):微生物(2008)臨字(0709)號(hào)，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn):GB20287－2006，有效微生物含量為2×109cfu/mL，主要成分為乳酸菌(Lactobacillus)、芽孢桿菌(Bacillus Cohn，1872)、酵母菌(yeast)、硝化細(xì)菌(nitrifying)。

1.2 養(yǎng)殖條件

海參養(yǎng)殖生產(chǎn)試驗(yàn)池東西走向，長(zhǎng)方形，周邊水泥板護(hù)坡，池底沙質(zhì)，面積1.33 hm2，水深1.0－1.5 m，池底每隔7 m 放置一排人工瓦礫礁石，水溫23.74 ～32.3℃，pH 值7.87 ～9.67，鹽度 24.21 ～29.06 g/L，溶解氧 DO 為4.65 ～12.0 mg/L，NH3－N 為0.46 ～1.7 mg/L，NO－2－N0為011 mg/L，NO－3－N0 為04～0.9 mg/L。試驗(yàn)自2010年8月10號(hào)開始，8月27號(hào)結(jié)束。

1.3 室內(nèi)試驗(yàn)

用塑料周轉(zhuǎn)箱，分別加水180 L，取參池表層底泥充分混勻，每箱加底泥10 kg，使其平鋪箱底。共分7組，第1至第6試驗(yàn)組依次添加1.0×109cfu/m3至6.0×109cfu/m3濃度的EM菌液，對(duì)照組添加等量蒸餾水，每組2個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)組和對(duì)照組加入底泥后靜止24 h，對(duì)各組水質(zhì)和底泥指標(biāo)采樣檢測(cè)，每隔24 h采樣檢測(cè)一次，連續(xù)檢測(cè)10 d。

1.4 室外池塘實(shí)驗(yàn)

選擇條件基本一致的生產(chǎn)性海參養(yǎng)殖池進(jìn)行，分別作為試驗(yàn)池和對(duì)照池，面積1.33 hm2，海參規(guī)格200 g，養(yǎng)殖密度9萬只/hm2。試驗(yàn)池每隔7 d潑灑1次EM菌原液，每次用量為2.4×109cfu/m3，對(duì)照池潑灑相同量的蒸餾水。每天檢測(cè)一次水質(zhì)指標(biāo)。

1.5 檢測(cè)項(xiàng)目和方法

水溫用YSI556MPS(美國產(chǎn))多參數(shù)水質(zhì)儀測(cè)定，NH－3－N、NO－2－N、NO－3－N、P03－4－P 等用 YSI9100(美國產(chǎn))分光光度計(jì)測(cè)定，COD用堿性高錳酸鉀法測(cè)定，底泥TN用半微量開氏法測(cè)定，底泥TP用酸容－鉬銻抗比色法測(cè)定。

1.6 計(jì)算公式

去除率=(對(duì)照組－試驗(yàn)組)/對(duì)照組*100%;平均去除率=(對(duì)照組平均值－試驗(yàn)組平均值)/對(duì)照組平均值*100%;最高去除率=對(duì)照組與試驗(yàn)組同一天最大差值/對(duì)照組對(duì)應(yīng)值*100%。

1.7 數(shù)據(jù)、圖表處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用方差分析法(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平p設(shè)定為0.05，用Microsoft Excel 2003進(jìn)行圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加EM菌對(duì)海參養(yǎng)殖水體中的作用

室內(nèi)試驗(yàn):各試驗(yàn)組的NH3－N含量總體呈先升后降的趨勢(shì)。Ⅰ組平均為1.48 mg/L，第5 d降至最低為1.00 mg/L;Ⅱ組平均為1.41 mg/L，第6 d降至最低為0.80 mg/L;Ⅲ組平均1.41 mg/L，第6 d降至最低為0.80 mg/L;Ⅳ組平均為1.17 mg/L，第6 d降至最低為 0.50 mg/L;Ⅴ組平均為1.30 mg/L，第 5 d降至最低為0.62 mg/L;Ⅵ組平均為1.21 mg/L，第6 d降至最低0.70 mg/L。對(duì)照組平均為1.90 mg/L，始終呈上升趨勢(shì)。Ⅳ組NH3－N去除效果最好，去除率達(dá)73.68%，平均去除率為38.42%，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)(圖1)。

室內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組NO－2－N的平均水平為0.44 mg/L，各試驗(yàn)組平均水平為0.34～0.39 mg/L，其中以Ⅴ組的降解效果最好，NO－2－N平均含量為0.34 mg/L，最低為0.25 mg/L。最高去除率為43.75%，平均去除率為22.73%，差異顯著(P＜0.05)(圖3)。室外池塘試驗(yàn)檢測(cè)情況:試驗(yàn)池平均NH3－N水平為0.66 mg/L，總體呈下降趨勢(shì)，第7 d降至最低為0.46 mg/L。對(duì)照池平均NH3－N水平為1.03 mg/L，且總體呈上升趨勢(shì)。試驗(yàn)池平均去除率為35.92%，試驗(yàn)池與對(duì)照池差異極顯著(P＜0.01)(圖2)。

室內(nèi)試驗(yàn)Ⅰ組 NO－3－N的平均值為0.31 mg/L，Ⅱ組為0.40 mg/L，Ⅲ組為0.40 mg/L，Ⅳ組為0.30 mg/L，Ⅴ組為0.38 mg/L，Ⅵ組為0.32 mg/L，對(duì)照組平均為0.58 mg/L。試驗(yàn)組與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)(圖5)。

室外池塘試驗(yàn)情況:試驗(yàn)池平均NO－2－N水平為0.023 mg/L，總體呈下降趨勢(shì)，第6 d降至最低為0.015 mg/L，對(duì)照池平均水平為0.037 mg/L，總體呈上升趨勢(shì)。試驗(yàn)池對(duì)NO－2－N的平均去除率為37.84%，試驗(yàn)池與對(duì)照池總體差異極顯著(P＜0.01)(圖4)。

室外池塘試驗(yàn)情況:試驗(yàn)池平均NO－3－N含量為0.27 mg/L，對(duì)照池平均含量0.13 mg/L，隨著試驗(yàn)進(jìn)行，試驗(yàn)池NO－3－N升高極顯著(P＜0.01)(圖6)。

室內(nèi)試驗(yàn)和池塘試驗(yàn)說明EM菌對(duì)NH3－N和NO－2－N有顯著降解作用，這與曹煜成等［9］、孟睿［10］等、齊欣等［11］、沈南南等［12］、黃永春［13］和劉建勇［14］等的結(jié)果一致。

添加EM菌對(duì)P03－4－P的降解作用

室內(nèi)試驗(yàn)情況:對(duì)照組P03－4－P平均檢測(cè)值為0.12 mg/L，各試驗(yàn)組平均檢測(cè)值在0.05～0.11 mg/L之間，顯著均低于對(duì)照組(P ＜0.05)，其中Ⅳ組最低，平均為0.05 mg/L，最低為 0 mg/L(第 4、6、7d)，平均去除率為58.33%(圖7)。

室外池塘試驗(yàn)情況:開始時(shí)對(duì)照池的P03－4－P為0.03 mg/L，試驗(yàn)池為0.07 mg/L，是對(duì)照池的2.33倍。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)試驗(yàn)池P03－4－P平均水平為0.04 mg/L，對(duì)照池平均水平為0.02 mg/L，是對(duì)照池的2.00倍，試驗(yàn)池總體下降33.00%，差異顯著(P＜0.05)(圖8)。

室內(nèi)外的試驗(yàn)結(jié)果證明，EM菌 對(duì)水體中的P03－4－P去除效果明顯。這與曹煜成等［9］的結(jié)果一致。

2.3 添加EM菌對(duì)水體化學(xué)耗氧量(COD值)的影響

室內(nèi)試驗(yàn)情況:對(duì)照組平均COD為4.65 mg/L，試驗(yàn)組平均COD在3.83－4.28 mg/L之間，各試驗(yàn)組均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。Ⅴ組最低，平均為3.83 mg/L，第6 d最低為3.12 mg/L，平均去除率為17.63%(圖9)。

室外池塘試驗(yàn)情況:添加EM菌液的試驗(yàn)池平均COD水平顯著低于對(duì)照池，且第2 d始呈緩慢下降趨勢(shì)，第6 d降至最低。試驗(yàn)池開始時(shí)COD為6.43 mg/L，結(jié)束時(shí)為4.95 mg/L，平均5.24 mg/L，平均降低18.51%，而對(duì)照池總體無明顯下降，添加EM對(duì)降低COD的效果極明顯(P＜0.01)(圖10)。

室內(nèi)外試驗(yàn)均說明，EM 菌對(duì)降低 COD 值的效果顯著。這與孟睿［10］等、齊欣等［11］、黃永春［13］、劉建勇［14］等的研究結(jié)果一致，但與沈南南等［12］、葉樂等［15］和馬江耀等［16］的研究結(jié)果不同，沈南南等認(rèn)為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis，BL)、莢膜紅假單胞菌(Rhodopseudomonas capsulate，RC)和乳酸桿菌(Lactobacillus spp，LB)對(duì)凡納濱對(duì)蝦工廠化養(yǎng)殖水質(zhì)各處理組中的P03－4－P、COD均無顯著效果;葉樂等、馬江耀等認(rèn)為，光和細(xì)菌、EM菌降低COD效果皆不明顯。這可能與不同試驗(yàn)者采用的試驗(yàn)菌株存在差異有關(guān)。

2.4 添加EM菌對(duì)底泥中TN值和TP值的影響

室內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果:Ⅰ組 TN 值為0.161 mg/L，Ⅱ組為0.172 mg/L，Ⅲ組為0.197 mg/L，Ⅳ組為0.160 mg/L，Ⅴ組為0.164 mg/L，Ⅵ組為0.200 mg/L，對(duì)照組為0.162 mg/L(圖11)。

室內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果:Ⅰ組底泥中TP值為0.042 mg/L，Ⅱ組為0.041 mg/L，Ⅲ組為0.043 mg/L，Ⅳ組為0.042 mg/L，Ⅴ組為 0.043 mg/L，Ⅵ組為0.052 mg/L，對(duì)照組為0.042 mg/L(圖12)。

各試驗(yàn)組TN、TP結(jié)果經(jīng)方差分析表明，變化均不顯著(P＞0.05)。

3 討論

3.1 添加EM菌液對(duì)改善養(yǎng)殖水體環(huán)境的效果

本研究發(fā)現(xiàn)，添加EM菌液對(duì)改善海參養(yǎng)殖水體環(huán)境具有良好效果，對(duì)于改善水體環(huán)境，降低氨氮等有毒有害物質(zhì)，降低化學(xué)耗氧量等具有十分顯著的效果。

EM菌是有益微生物的總稱，它通過氧化、氨化、硝化、反硝化、硫化、解磷、固氮等作用，將動(dòng)物排泄物、殘餌、糞便等分解為二氧化碳(CO2)、硝酸鹽(NO－3－)、磷酸鹽(PO3－4－)、硫酸鹽(S2－－)等，有效地降解有機(jī)污染物，改良水質(zhì)，是物質(zhì)循環(huán)不可缺少的環(huán)節(jié)［2－3］。

人們對(duì)于EM在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用做了大量研究，王夢(mèng)亮［4］用光和細(xì)菌(photossynthetic bacteria)使水體溶解氧(DO)增加了68%，化學(xué)耗氧(COD)下降了21%，氨氮(NH3－N)下降了58.7%，硝酸氮(NO－3－N)下降了29.4%，硫化物(S2－－)下降了77.4%。楊艷等［5］用巨大芽孢桿菌(megaterium)對(duì)養(yǎng)魚水質(zhì)進(jìn)行了凈化研究。劉慧玲［6］進(jìn)行了光合細(xì)菌降解水體亞硝酸鹽(NO－2－)的研究。NOGAMI［7］等探討了有益菌在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)中的應(yīng)用，曹煜成等［8］研究了地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis strain)對(duì)草魚養(yǎng)殖水體的改善，都取得了良好效果。

海參對(duì)許多藥物都較敏感，應(yīng)急反應(yīng)強(qiáng)烈，若用藥不當(dāng)，極易引起身體溶解、生長(zhǎng)停滯或死亡。在海參養(yǎng)殖中須盡量避免或減少藥物使用，因此，充分利用EM菌綜合改善和調(diào)節(jié)海參養(yǎng)殖水環(huán)境意義重大。

3.2 EM菌液對(duì)海參養(yǎng)殖水體中含氮物的改良效果

通過室內(nèi)和室外池塘試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EM菌對(duì)NH3－N、NO－－2N、PO3－4－P、COD等指標(biāo)皆有明顯的去除效果。但是，NO－3－N的室內(nèi)試驗(yàn)與室外池塘試驗(yàn)結(jié)果不一致，室內(nèi)試驗(yàn)中NO－3－N的變化不明顯，而室外添加EM菌液的試驗(yàn)池塘中，NO－3－N非但沒有降低，反而升高幅度顯著(P＜0.01)，這可能與試驗(yàn)池溶氧充足，而室內(nèi)試驗(yàn)門窗關(guān)閉，溶氧偏低有關(guān)。在氧氣充足的情況下，好氧細(xì)菌活躍，硝化作用強(qiáng)烈，NH4+－N、NO－2－N在硝化細(xì)菌的作用下轉(zhuǎn)化為NO－3－N較徹底，因而，形成 NO－3－N較高濃度的積累［17］。劉福軍、胡文英［18］在研究光合細(xì)菌對(duì)鹽堿地池塘水質(zhì)改良時(shí)也發(fā)現(xiàn)了NO－3－N升高的情況。

3.3 EM菌液對(duì)海參養(yǎng)殖池底泥TN、TP降解效果不明顯的原因

各試驗(yàn)組底泥中的TN和TP變化不顯著(P＞0.05)，分析其中的原因，一是與試驗(yàn)時(shí)間較短有關(guān)，EM菌液的作用還沒有完全發(fā)揮出來。二是與EM菌的使用方法有關(guān)，我們采用的是潑灑法，這種方法方便快捷，較適合于對(duì)溶解或凝聚于水體中污染物的降解，而對(duì)底泥中污染物降解的效果不如底施法好。

3.4 EM菌的適宜濃度及使用周期

本研究發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)各試驗(yàn)組施加EM菌液后，除了對(duì)底泥中TN、TP在的效果不明顯外，其它NH3－N、PO3－4－P等指標(biāo)皆以Ⅳ組(添加濃度為4.0×109cfu/m3)為最好，Ⅴ組(5.0×109cfu/m3)對(duì) NO－2－N和COD兩項(xiàng)指標(biāo)的去除效果較好。方云東［19］等對(duì)EM菌在南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究結(jié)果表明，添加EM菌液濃度為2 mg/L的綜合凈水效果最好，但對(duì)EM菌的有效微生物含量沒有提及。陸家昌等［20］研究認(rèn)為，枯草芽孢桿菌投放濃度為1.25×104cfu/mL時(shí)，對(duì)水體COD、NH3－N、NO－2－N的降解效果最好。

本研究結(jié)果表明，一般在添加EM菌液5～7 d后便會(huì)出現(xiàn)拐點(diǎn)，張明磊等［21］在研究光合細(xì)菌對(duì)鹽堿地水質(zhì)的改善作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，8 d左右出現(xiàn)拐點(diǎn)。綜合試驗(yàn)研究結(jié)果并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際認(rèn)為，每7～10 d使用一次EM菌原液，每次使用的有效微生物含量為4.0～5.0×109cfu/m3是較適宜的。沈南南等研究認(rèn)為，微生態(tài)制劑的使用并非濃度越高越好，也不是時(shí)間越短越好，7 d左右較適宜［12］。當(dāng)然，使用周期和使用量與池塘水質(zhì)狀況、底質(zhì)狀況、負(fù)載量等因素密切相關(guān)，況且不同研究者采用的微生物制劑的有效微生物組成、含量、生理活性、生態(tài)特點(diǎn)各異，不能一概而論。

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