唐秀麗，付衛(wèi)東 ，張國良，張衍雷，譚萬忠

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081;2.西南大學植物保護學院外來入侵生物研究中心，重慶北碚 400716)

黃頂菊Flaveria bidentis(L.)Kuntze是一種外來入侵植物。2001年首次在我國衡水湖發(fā)現(xiàn)，后相繼出現(xiàn)在河北邢臺、廊坊和天津等地，局部已經(jīng)形成了黃頂菊種群［1－2］，對我國生態(tài)環(huán)境與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴重的危害［3－4］。黃頂菊是一年生草本，原產(chǎn)于南美洲［5－6］，屬菊科(Asteraceae)堆心菊族(Helenieae)黃頂菊屬(Flaveria)［3］。黃頂菊對農(nóng)作物尤其是玉米田的危害尤為嚴重，在玉米整個生長期，黃頂菊均可危害［7］。國內(nèi)外對黃頂菊的研究主要以生物學特性方面居多［4，8，9，10］。近年來，關(guān)于黃頂菊化感作用方面的研究也越來越多，植物化感作用是自然界普遍存在的一種現(xiàn)象，是植物生存的重要機制，也是外來植物入侵的一種重要機制［11，12］。已相繼有黃頂菊水提液對綠豆種子［13］、小麥種子［14］、玉米種子［15］、油菜及油麥種子［16］等發(fā)芽指數(shù)方面［17，18］的報道。但是，關(guān)于黃頂菊對受體植物生理生化的影響報道少之又少，而對幼苗根尖的顯微形態(tài)特征方面目前還沒有報道。本試驗以玉米為受體，探討黃頂菊對玉米的化感效應(yīng)，為揭示黃頂菊對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的危害機制及抑制其蔓延有著重要意義，從而為綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黃頂菊及其根際土壤采自河北省滄州市獻縣陌南村(E:115.62°，N:38.46°)，該地區(qū)是黃頂菊在河北的重度發(fā)生地，黃頂菊已經(jīng)定植并且形成單一群落。

供試受體玉米(Maize L.，紀元1號)，購于中國農(nóng)業(yè)科學院作物所。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃頂菊水提液制備取新鮮黃頂菊地上部分植株100 g，稍除枯枝黃葉后，整株用蒸餾水1000 mL于室溫下浸泡36 h，后經(jīng)4層定性濾紙抽濾得水提液，再將水提液用微孔濾膜(0.45 μm)過濾，以此為母液(0.1 gDW/mL)，稀釋成濃度為0.05 gDW/mL和0.01 gDW/mL，以供生物活性測定試驗，后置入冰箱內(nèi)4 ℃ 保存［19］。

1.2.2 玉米幼苗的準備 選取飽滿度和大小基本一致的玉米種子，用0.5%H2O2處理5 min，后用蒸餾水反復清洗，置于恒溫水浴鍋內(nèi)30℃催芽3 d(每天換新鮮水1次)。玉米幼苗培育采用沙培加營養(yǎng)液法，所以石英細沙于10%鹽酸浸泡24 h后反復沖洗至pH 7.0左右，再用160℃烘干滅菌以供使用。營養(yǎng)液采用1/4強度Hoagland營養(yǎng)液［20］，PH調(diào)至5.8。在白瓷盆內(nèi)播入已催芽且芽長基本一致的玉米種子，于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件12 h/12 h，30℃/25℃)，7 d后幼苗供試驗使用。

表1 1/4強度Hoagland營養(yǎng)液配方Table 1 Prescription of the 1/4 strength Hoagland

1.2.3 對玉米幼苗的處理 將50 mL 三種不同濃度(0.1 gDW/mL、0.05 gDW/mL、0.01 gDW/mL)黃頂菊水提液中，分別加入50 mL1/4強度Hoagland營養(yǎng)液，后于振蕩器上混勻3 min，移入培育后的玉米幼苗，每個白瓷盆中5株，置于溫室中。無菌水為對照。分別處理后第4 d、第8 d、第12 d和第16 d取樣，每個處理6個重復，整個試驗共進行了三次重復。記錄各盆中玉米株高，每盆隨機選擇玉米葉片0.5 g進行可溶性蛋白［21］、可溶性糖類［21］、脯氨酸［22］含量的測定。

1.2.4 幼苗根尖顯微形態(tài)觀察 選取最高濃度0.1 gDW/mL黃頂菊處理以及對照處理中玉米幼苗根尖生長點部位分別用生理鹽水沖洗3次，每次5 min，再用3%戊二醛固定液24 h后，依次用30%、50%、70%、80%、90%的乙醇系列脫水(每一梯度脫水20 min)，最后100%的乙醇脫水兩次，后乙酸異戊酷置換，再用CO2臨界點干燥，粘于銅片噴金度膜，最后再用掃描電鏡(日立S－4800)下觀察并照相［23－25］。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用Excel2003對數(shù)據(jù)進行處理，并采用SPSS16.0軟件進行方差分析，組內(nèi)多重比較采用Duncan’s新復極差法，計算值并作顯著性檢驗，所有圖標數(shù)據(jù)表示均為平均數(shù)±標準差(Means±S.D.)。

2 結(jié)果分析

2.1 黃頂菊水提液對玉米幼苗葉片可溶性蛋白的影響

不同濃度黃頂菊水提液處理玉米幼苗體內(nèi)可溶性蛋白含量產(chǎn)生了一定的影響(圖1)，方差分析結(jié)果表明不同濃度和不同處理時間后幼苗葉片的可溶性蛋白含量出現(xiàn)極顯著性差異(F3，48=1365，P=0.0001;F3，48=460.913，P=0.0001)。且不同化感物質(zhì)濃度和不同處理時間之間存在極顯著的交互作用(F9，48=36.426，P=0.0001)，即不同濃度黃頂菊水提液對可溶性蛋白含量的影響隨著處理時間的變化而異。自處理后第4 d開始，玉米幼苗葉片可溶性蛋白含量和對照中相比出現(xiàn)顯著的活性差異，對照中可溶性蛋白含量由 1.14 μg/g·FW 增加到 5.58 μg/g·FW。兩個高濃度(0.05 gDW/mL 和 0.1 gDW/mL)處理后，含量分別由 0.38 μg/g·FW 增加到 0.59 μg/g·FW，0.09 μg/g·FW 增加到 0.42 μg/g·FW。和對照相比增幅不大。組內(nèi)多重比較表明，玉米幼苗葉片可溶性蛋白含量隨著處理濃度增加而逐漸增加，隨著處理時間的延長而逐漸減少。

圖1 黃頂菊水提液對玉米幼苗葉片可溶性蛋白含量的影響Fig.1 Impacts of F.bidentis aqueous extracts on contents of soluble protein in leaves of maize seedlings

2.2 黃頂菊水提液對玉米幼苗葉片可溶性糖類的影響

不同濃度黃頂菊水提液處理對玉米幼苗體內(nèi)可溶性糖含量產(chǎn)生了一定的影響(圖2)，方差分析結(jié)果表明不同濃度和不同處理時間后幼苗葉片的可溶性糖含量出現(xiàn)極顯著性差異(F3，48=30580，P=0.0001;F3，48=5415，P=0.0001)。且不同化感物質(zhì)濃度和不同處理時間之間存在極顯著的交互作用(F9，48=3296，P=0.0001)，即不同濃度黃頂菊水提液對可溶性糖含量的影響隨著處理時間的變化而異。自處理第4 d開始，對照中可溶性糖類含量變化不大，由20.18 μmol/g變化為22.08 μmol/g，增幅僅為9.4%。最低濃度0.01 gDW/mL和最高濃度0.1 gDW/mL處理后，增幅分別達到45.9%和43.3%。組內(nèi)多重比較表明，玉米幼苗葉片可溶性糖含量隨著處理濃度增加和處理時間的延長而逐漸增加。

2.3 黃頂菊水提液對玉米幼苗脯氨酸含量的影響

不同濃度黃頂菊水提液處理后對玉米幼苗體內(nèi)脯氨酸含量產(chǎn)生了一定的影響(圖3)，方差分析結(jié)果表明不同濃度和不同處理時間后幼苗葉片的脯氨酸含量出現(xiàn)極顯著性差異(F3，48=9119，P=0.0001;F3，48=518.916，P=0.0001)。且不同化感物質(zhì)濃度和不同處理時間之間存在極顯著的交互作用(F9，48=68.92，P=0.0001)，即不同濃度黃頂菊水提液對脯氨酸的影響隨著處理時間的變化而異。兩個最高濃度處理后第4 d到第12 d，脯氨酸含量分別增幅25.5%和37.0%，相對于對照中脯氨酸含量增幅9%，變化明顯。組內(nèi)多重比較表明，玉米幼苗葉片脯氨酸含量隨著處理濃度增加和處理時間的延長而逐漸增加。

2.4 幼苗根尖顯微結(jié)構(gòu)

經(jīng)最高濃度(0.1gDW/mL)黃頂菊水提液處理后，和對照相比，根尖表皮細發(fā)生了明顯的變化。高濃度處理下表皮脫落細胞很多，根冠頂部細胞干癟，部分脫落，尤其在頂部表層細胞，很多僅剩下空的細胞腔。內(nèi)層細胞已經(jīng)基本暴露出來，根冠頂部細胞大部分破裂。在×500倍的結(jié)果中可見，對照的根尖細胞排列規(guī)則且細胞成長圓形，形態(tài)明顯，細胞比較扁平且飽滿。被化感物質(zhì)處理后，幼苗根尖細胞排列出現(xiàn)紊亂，明顯膨脹，細胞內(nèi)細胞質(zhì)明顯淡稀，空殼細胞。

3 結(jié)果與討論

河北農(nóng)大研究，黃頂菊對玉米脅迫時，可溶性蛋白含量減少［26］。生長在逆境環(huán)境中的植物其代謝反映變化趨勢相同，即水解作用增強，合成作用減弱。由本研究結(jié)果可知，隨著黃頂菊水浸提液質(zhì)量濃度的增加，可溶性蛋白含量呈下降趨勢，這可能是因為生長在含有黃頂菊環(huán)境中的玉米幼苗的生長受到抑制，其體內(nèi)的水解作用增強，將可溶性蛋白降解為氨基酸。這種代謝失調(diào)最終產(chǎn)生植物的傷害作用。這與黃花蒿對小麥幼苗的化感作用一樣［27］。

圖4 黃頂菊水提液處理后玉米幼苗根尖細胞的變化Fig.4 Celluar changes of upland maize seedling roots treated with extracting liquor from F.bidentis

可溶性糖是植物體內(nèi)主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，逆境脅迫條件下，作為植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的可溶性糖含量的增加可以增加植物體內(nèi)的滲透勢，以利于植物體在逆境中維持體內(nèi)正常的所需水分，提高植物的抗逆性［28］。實驗表明黃頂菊植株水提液處理下玉米葉片中可溶性糖含量增加?？扇苄蕴呛康脑黾右环矫婺苡行岣呷~片細胞的滲透勢，增強玉米幼苗對逆境脅迫的耐受性;另一方面，可溶性糖在玉米體內(nèi)的積累，減少了糖類物質(zhì)向其它物質(zhì)的轉(zhuǎn)變，從而阻礙了玉米幼苗的正常生長。類似與黃頂菊水提液對小麥幼苗的化感作用影響［29］，但是與芒其對玉米幼苗中可溶性糖類的影響有一些不同［30］。

脯氨酸(Pro)是植物在逆境脅迫下體內(nèi)積累的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一［31］。正常情況下，植物體內(nèi)的Pro含量較低，脅迫時含量便會大大增高，并且積累指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)。因此Pro可作為植物抗逆性的一項生理生化指標［32］。通過本試驗可知，不同濃度黃頂菊水提液脅迫下玉米幼苗，Pro含量差異均達極顯著。且Pro含量隨著黃頂菊水提液濃度的升高而升高，不同濃度處理時均比對照中脯氨酸含量要高。這與關(guān)于SO2對玉米幼苗中Pro影響趨勢一樣［33］。在黃頂菊水提液濃度為0.01 gDW/mL條件下，玉米幼苗葉片的脯氨酸含量的變化不大，說明玉米具有一定的耐受性。當濃度達到0.05 gDW/mL和0.1 gDW/mL條件下，脯氨酸含量急劇增加。而在后期，脯氨酸增加量幅度不大，處理中黃頂菊對玉米幼苗的抑制作用已經(jīng)使得玉米不能正常生長。黃頂菊水提液處理下玉米葉片脯氨酸含量的增加有兩種可能，一方面是黃頂菊水提液阻斷了玉米幼苗根部游離氨基酸向蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化，使游離脯氨酸含量增加;二是黃頂菊水提液能增加蛋白質(zhì)的降解速度，加快游離脯氨酸的積累。這說明黃頂菊水提液對玉米的生長有較強的抑制作用，但黃頂菊水提液對游離脯氨酸含量增加的影響機制還需要進一步研究。

根系是作物直接感受外界水分信號并吸收水分的器官，與作物抗逆性形成密切相關(guān)。關(guān)于紫羊茅(Festuca rubra L.)對水芹(Oenanthe stolonifera(Roxb)Wall)和一種蟹草(Lygodium japonicum(T.)S.)的化感作用研究，發(fā)現(xiàn)其化感分泌部位在須根尖的局部細胞中［34］。黃頂菊水提液對玉米幼苗的化感作用，同樣體現(xiàn)在對幼苗根長的生長狀況上，類似于黃花蒿對小麥幼苗的影響［27］。根尖細胞的外觀和解剖結(jié)果表明，玉米幼苗的根系生長和發(fā)育已嚴重受到抑制和干擾，主要表現(xiàn)在幼苗根尖細胞形態(tài)和大小的變化。應(yīng)用掃描電鏡研究紫莖澤蘭水提液對玉米根的形態(tài)影響，結(jié)果顯示處理后的玉米根尖生長受到嚴重干擾，根尖表皮出現(xiàn)明顯脫落甚至腐爛，與本試驗研究結(jié)果相一致［35］。

化感物質(zhì)作為一種信息載體物質(zhì)幾乎存在于植物的所有器官中。對黃頂菊化感作用的研究，本實驗選用受體植物內(nèi)最直接明確的生理指標和形態(tài)指標，從而為后續(xù)探究黃頂菊化感作用機制奠定一定的基礎(chǔ)。

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