祁艷霞，張小輝，龐有志，王玉琴，廖 輝

(河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽(yáng)471003)

牛肌肉的發(fā)育狀況是影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要因素，選育肌肉發(fā)育快、肉質(zhì)好的牛品種是家畜育種的目標(biāo)之一．肌肉發(fā)育受一系列基因的調(diào)控，因此，肌肉發(fā)育的基因表達(dá)調(diào)控一直受到廣泛的關(guān)注．肌肉組織是胚胎發(fā)育過(guò)程中最早形成的組織之一．以肌肉發(fā)生調(diào)控因子(Myogenic regulatory factors，MRFs)為核心的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)在肌細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用［1］．MyoD(Myogenic differentiation 1)為MRFs家族成員之一，在骨骼肌細(xì)胞中表達(dá)，可激活下游肌肉特異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞分化，使很多非肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌細(xì)胞［2］．MEF2(Myocyte enhancer factor2)屬于MADS(MCM1 agamous deficiens serum response factor)框轉(zhuǎn)錄因子家族，脊椎動(dòng)物MEF2蛋白由 4種亞基組成，分別由 MEF2A，MEF2B，MEF2C和MEF2D基因編碼．轉(zhuǎn)錄因子MEF2的DNA結(jié)合位點(diǎn)是一段保守的序列，該序列廣泛存在于肌肉組織特異性表達(dá)基因的調(diào)控區(qū)，MEF2與MyoD基因家族成員具有協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)胚胎期的肌肉發(fā)育［3］．動(dòng)物出生后的肌肉發(fā)育以肌纖維肥大為主［4］，同時(shí)，肌間脂肪的沉積速度逐漸加快［5］．因此，本研究利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析了南陽(yáng)黃牛出生后3月齡到24月齡之間背最長(zhǎng)肌組織中MyoD和MEF2基因的表達(dá)變化模式，為進(jìn)一步深入研究MyoD和MEF2基因在動(dòng)物出生后的肌肉發(fā)育調(diào)控過(guò)程中的作用提供基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1．1 組織樣品的采集

選擇發(fā)育正常的3，6，12，18，24 月齡的南陽(yáng)黃牛各4頭，在無(wú)菌條件下分別采集背最長(zhǎng)肌組織，立即投入液氮中保存?zhèn)溆茫?/p>

1．2 總RNA的提取及檢測(cè)

用Takara公司的RNAiso plus試劑盒提取各組織總RNA．利用A260:A280確定RNA的純度，通過(guò)0．8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，根據(jù)18S rRNA的亮度計(jì)算總RNA的濃度，用DEPC處理的雙蒸水稀釋至1 g·L－1備用．

1．3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析

分別將 3，6，12，18，24 月齡南陽(yáng)牛背最長(zhǎng)肌組織的總RNA各300 ng用DNAse(Promega)處理，以去掉殘存的基因組DNA，用Takara公司的PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA第1鏈，以此 cDNA第1鏈為摸板，用Takara公司生產(chǎn)的SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行熒光定量分析(Stratagene Mx3005P)，總的反應(yīng)體系為20 μL，其中模板 cDNA 第1鏈1 μL，10×SYBR?Premix Ex TaqTM2 μL，上、下游引物各0．7 μL，ddH2O 7．6 μL．反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 預(yù)變性1 min;然后94℃變性 30 s，退火 30 s，72 ℃延伸30 s，42個(gè)循環(huán)．對(duì)所有樣本進(jìn)行3個(gè)重復(fù)測(cè)定，并在每次試驗(yàn)時(shí)設(shè)陰性對(duì)照．本研究用到的引物序列信息見(jiàn)表1．

表1 熒光實(shí)時(shí)定量分析的引物信息表Table 1 The information of primers for real time PCR analysis

1．4 基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析

參照 WINER 等［6］方法，用 2－ΔCt法測(cè)定目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化．通過(guò)方差分析對(duì)不同發(fā)育時(shí)期背最長(zhǎng)肌組織的基因表達(dá)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，采用BON法進(jìn)行多重比較．

2 結(jié)果與分析

2．1 MyoD基因在牛肌肉發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化

隨著南陽(yáng)黃牛月齡的增加，MyoD基因在背最長(zhǎng)肌組織中的表達(dá)表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)(表2)．MyoD基因在3月齡時(shí)表達(dá)量最低，隨后表達(dá)量顯著升高(P＜0．05);在18月齡時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高值，與其它月份之間差異均顯著(P＜0．05);24月齡時(shí)表達(dá)量顯著降低(P＜0．05)．

2．2 MEF2基因在牛肌肉發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化

脊椎動(dòng)物MEF2蛋白由4種亞基組成，分別由 MEF2A，MEF2B，MEF2C，MEF2D 基因編碼．隨著南陽(yáng)黃牛月齡的增加，各編碼基因在背最長(zhǎng)肌組織中的表達(dá)趨勢(shì)也存在一定差異，見(jiàn)表2．MEF2A基因在南陽(yáng)黃牛背最長(zhǎng)肌組織中的表達(dá)也表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，該基因在3月齡時(shí)表達(dá)量最低，在12月齡和18月齡時(shí)表達(dá)量顯著升高(P＜0．05)，隨后表達(dá)量下降，但差異不顯著(P＞0．05)．MEF2B基因在背最長(zhǎng)肌組織中的表達(dá)呈持續(xù)的上升趨勢(shì)，24月齡時(shí)表達(dá)量最高．MEF2C基因在肌肉組織中的表達(dá)量相對(duì)較低，在肌肉發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化幅度比較小，MEF2C基因在3月齡時(shí)表達(dá)量最低，18月齡時(shí)表達(dá)量最高，差異顯著(P＜0．05)．MEF2D基因的表達(dá)情況與MyoD基因一致，表現(xiàn)出明顯的先升高后降低趨勢(shì)，18月齡和24月齡時(shí)表達(dá)量比3月齡時(shí)顯著高(P ＜0．05)．

表2 MyoD和MEF2基因在南陽(yáng)黃牛背最長(zhǎng)肌發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化Table 2 The expression of MyoD and MEF2 during the development of longissimus dorsi muscle in Nanyang cattle

3 小結(jié)與討論

1)MyoD是調(diào)控肌肉生成的重要基因，其表達(dá)對(duì)維持肌細(xì)胞分化有重要作用，胚胎期MyoD基因缺失可導(dǎo)致成肌細(xì)胞的增殖和分化無(wú)法進(jìn)行［7］．肌細(xì)胞屬于去分化能力的細(xì)胞，其數(shù)量在動(dòng)物出生后基本恒定，肌肉細(xì)胞一旦受傷，則組織中的衛(wèi)星細(xì)胞又可以再次分裂，生成新的肌肉細(xì)胞，MyoD在此過(guò)程中也發(fā)揮了重要的作用［8］．MyoD基因在劇烈運(yùn)動(dòng)后的小鼠骨骼肌組織中表達(dá)水平上升，即表明該基因參與了損傷后骨骼肌細(xì)胞的修復(fù)過(guò)程［9］．MyoD基因在出生后的動(dòng)物肌肉組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與肌肉發(fā)育的豐滿程度存在一定關(guān)系，長(zhǎng)白豬肌肉組織中MyoD基因的表達(dá)水平極顯著高于八眉豬［10］．此外，MyoD基因的某些SNPs也影響肌肉的發(fā)育和胴體品質(zhì)［11，12］．這些研究表明，MyoD基因在多個(gè)方面對(duì)肌肉的發(fā)育進(jìn)行調(diào)節(jié)，不僅是mRNA的表達(dá)量，而且蛋白的表達(dá)量和活性對(duì)肌肉發(fā)育也能發(fā)揮調(diào)控作用．

2)脊椎動(dòng)物中目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)4種類型的MEF2基因，分別由4個(gè)基因編碼，而且這4個(gè)基因分別位于不同染色體上，每一個(gè)MEF2基因都有其獨(dú)特的時(shí)空表達(dá)模式［13］．MEF2基因通過(guò)啟動(dòng)子的選擇及mRNA的選擇性拼接可產(chǎn)生多種不同的MEF2蛋白質(zhì)．許多骨骼肌和心肌中特異性表達(dá)基因的調(diào)控區(qū)都存在MEF2的結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明該基因在調(diào)節(jié)骨骼肌和心肌細(xì)胞系的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的作用［14］．MEF2轉(zhuǎn)錄因子主要促進(jìn)I型肌纖維的生成［15］．它最突出的功能是控制肌細(xì)胞分化過(guò)程中的基因轉(zhuǎn)錄，主要在骨骼肌、心肌和平滑肌的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用．MEF2與其它肌肉組織特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子具有協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)肌細(xì)胞的分化．在骨骼肌中，MEF2就需要與MyoD家族成員協(xié)同作用來(lái)激活其它基因的轉(zhuǎn)錄［16］．MEF2A在骨骼肌中的表達(dá)量比心肌組織中高［17］．MEF2基因的表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞的正常分化和功能維持也是必要的，MEF2A和MEF2C基因的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致擴(kuò)張性心肌癥［18］．MEF2A基因具有豐富的多態(tài)性，其中部分SNPs位點(diǎn)與胴體品質(zhì)和胸肌發(fā)育有關(guān)［19］．MEF2C基因缺乏時(shí)骨骼肌發(fā)育不良，說(shuō)明MEF2C基因?qū)±w維維護(hù)與成熟發(fā)揮重要作用［20］．本研究發(fā)現(xiàn)，MEF2基因家族的4個(gè)成員在牛背最長(zhǎng)肌組織的發(fā)育過(guò)程中表達(dá)情況各不相同，且不同的MEF2基因的基礎(chǔ)表達(dá)水平存在比較大的差異．

MyoD和MEF2都是調(diào)控胚胎期肌肉細(xì)胞發(fā)育的重要基因，本研究發(fā)現(xiàn)這2個(gè)基因在出生后的牛肌肉組織中也具有比較高的表達(dá)量，而且每個(gè)基因的表達(dá)變化模式不同，表明這些基因的表達(dá)在動(dòng)物出生后仍然受到精密的調(diào)控，可能在肌肉細(xì)胞的肥大或肌間脂肪的沉積上發(fā)揮重要的作用．

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